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1.目的镉(Cadmium,Cd)及其化合物是常见的工业毒物和环境污物,进入机体内的镉可引起多种组织器官的损害,甚至导致肿瘤的发生。根据国际癌症研究组织(IARC)的报告,镉及其化合物是确认的第一类致癌物,是人类危害最大的金属毒物之一。因此,镉暴露及其健康损害,特别是镉低水平长期毒作用已经成为毒理学研究的热点,其中关于DNA修复基因在亚慢性镉暴露动物体内的表达变化鲜见报道。本实验通过创建大鼠亚慢性镉暴露模型,对镉低水平较长期致大鼠的损伤及其与DNA修复基因ERCC1表达变化的关系进行研究,为镉化物对机体的亚慢性损伤及其毒作用机制补充新的实验数据。2.方法2.1在急性毒性试验的基础上,用SPF级别SD大鼠96只按体重随机分4组,3个CdCl2染毒组(高剂量1.225mg/kg、中剂量0.612mg/kg和低剂量0.306mg/kg)和1个生理盐水对照组(0.9% NaCl),每组24只大鼠,雌雄各半,腹腔注射,每天1次,每周5天,连续14周。然后对大鼠进行24小时尿液收集,穿刺心脏采血,剖杀切取内脏器官并对其进行称重。2.2用原子吸收分光光度法测定肝和肾组织的镉含量,计算肝脏和肾脏的脏器系数,同时从每组中随机抽出4只大鼠(雌雄各半),分别对其肝脏和肾脏进行病理切片以观察组织形态学变化。测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)作为肝功能生化指标,测定血中尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)、尿肌酐(CR)以及24小时尿蛋白(24hPro)作为肾功能生化指标。2.3在构建亚慢性镉暴露大鼠模型的基础上,探讨DNA修复基因ERCC1在肝和肾组织中的表达情况。根据ERCC1基因的mRNA序列,用Primer Express 2.0软件设计ERCC1上下游引物。应用Trizol试剂盒并按照其一步法提取大鼠肝组织和肾组织中总RNA,经逆转录(RT)后用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法分析其ERCC1基因的表达情况。2.4分析雌雄大鼠的肝、肾脏器系数及其与镉含量的关系,进一步对大鼠肝脏和肾脏的ERCC1基因表达水平与肝、肾镉含量,以及肝、肾功能变化分别作关联性分析。数据均以x±s表示,运用t-检验、方差分析、Games-Howell检验、Student- Newman-Keulsa检验和相关分析等对数据进行处理,P<0.05有统计学意义。3.结果3.1大鼠经过不同镉浓度染毒14周后,不同镉暴露的大鼠肝、肾脏器中的镉含量均有不同程度升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,存在明显的剂量依赖关系(P<0.01)。实验组大鼠肝、肾组织的脏器系数均有不同程度增大,并随着镉的暴露水平的增加而增大,具有明显的剂量依赖关系(P<0.01)。实验组大鼠肝、肾组织的病理切片中与对照组相比也均观察到明显的病理学改变。提示亚慢性CdCl2染毒已经引起肝、肾靶器官不可逆的的严重损伤。3.2亚慢性染毒试验的结果显示,CdCl2染毒的大鼠中肝功能生化指标AST和ALT的活性以及肾功能生化指标Scr、BUN和24hPro的活性等,相对于对照组均有不同程度的升高,并随着镉的暴露水平的增加而升高,具有明显的剂量-反应关系(P<0.05)。这些数据显示镉亚慢性染毒已经引起肝、肾组织的不同程度的损害并出现了功能性的改变。以上检测结果显示雌雄大鼠的变化趋势相同,而且雄性大鼠的变化有大于雌性大鼠变化的趋势。3.3经FQ-PCR分析,肝脏和肾脏的ERCC1基因的表达量以β-actin为内参照进行标化计算,在镉高、中、低剂量染毒大鼠组中,肝脏ERCC1表达量分别是对照组的66.7%、70.9%和74.3%,而肾脏ERCC1表达量分别是对照组的69.4%、79.39%和85.2%,显示随着大鼠CdCl2暴露水平的升高而其肝、肾的ERCC1表达水平下调更明显,具有明显的剂量-反应关系(P<0.01),而且随着染镉剂量的升高雌性大鼠ERCC1表达量的降低程度比雄性大鼠更为明显。3.4经过统计学的相关性分析,发现大鼠肝、肾靶器官的ERCC1 mRNA表达量与大鼠肝、肾中的镉蓄积浓度呈负相关关系;大鼠肝、肾中的ERCC1 mRNA表达水平还分别与肝功能生化指标(AST,ALT)和肾功能生化指标(24hpro,BUN, Scr)异常存在负相关关系,并与肝、肾组织的病理学改变相关。结果表明,肝、肾靶器官的ERCC1基因表达水平与大鼠的镉暴露程度、肝和肾组织中的镉镉蓄积浓度及其引起的内脏器官异常效应呈现出良好的负相关性(P<0.01或P<0.05)。4.结论4.1构建了大鼠亚慢性镉暴露模型,发现镉可以引起肝、肾脏器系数的增大和不同程度的病理改变,同时引起肝、肾生化功能的改变,有明显的剂量-反应关系,表明镉对肝、肾等靶器官均产生明显的毒性损害并得到病理学证实,为镉化物对机体的亚慢性损伤及其毒作用机制补充新的实验数据。4.2在亚慢性镉中毒模型中观察到镉对大鼠内脏器官DNA修复基因ERCC1表达的诱导作用,揭示大鼠肝、肾ERCC1基因表达下调与肝、肾组织的镉蓄积量及其引起的内脏器官异常效应呈现出良好的剂量-反应关系,提示ERCC1基因的表达改变有可能成为一个有价值的镉亚慢性暴露或效应生物标志物。