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试验一硫酸化壳聚糖硒的有机合成及鉴定
本试验通过单因子试验和正交试验确定硫酸化壳聚糖硒的最佳合成条件，进而应用紫外光谱和红外光谱分析进行结构表征。用脱乙酰度为92％的壳聚糖(CTS)3g、二氯乙酸3.5mL、甲酰胺50mL、二甲基甲酰胺(DMF)50mL和氯磺酸10mL，在60℃条件下反应2h，合成含硫量为36％的壳聚糖硫酸酯;以壳聚糖硫酸酯为原料，比较壳聚糖硫酸酯与亚硒酸钠不同pH、反应时间、反应温度和质量比对硫酸化壳聚糖硒的硒含量和硫含量的影响。结果显示，pH为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0条件下，制备的硫酸化壳聚糖硒的硒含量分别为8.86±0.05、6.78±0.79、5.51±0.19、6.46±0.68和8.06±0.81mg·g-1，pH3.0组显著高于pH4.0、5.0和6.0组(P＜0.05);硫含量分别为181.54±3.18、207.43±12.20、221.28±15.96、189.97±35.36和208.93±5.92mg·g-1，pH3.0组显著低于pH5.0组(P＜0.05)，与其他各组差异不显著（P＞0.05）。反应时间为0.5h、1h、2h、3h和4h条件下，硫酸化壳聚糖硒中硒含量分别为36.50±0.59、33.61±3.08、33.14±2.03、35.34±2.64和32.07±0.63mg·g-1，反应0.5h组的硒含量显著高于4h（P＜0.05），与其他各组差异不显著（P＞0.05）;硫含量分别为259.81±8.14、264.93±4.27、287.81±12.57、282.24±6.89和279.53±11.79mg·g-1，反应0.5h组的硫含量显著低于2h、3h和4h（P＜0.05）。反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃和60℃条件下，硫酸化壳聚糖硒的硒含量分别为41.46±1.34、43.96±0.21、43.07±0.19、42.27±0.36和40.93±1.57mg·g-1，反应温度为30℃组硫含量显著高于20℃和60℃(P＜0.05);硫含量分别为273.36±10.42、276.22±12.37、276.07±3.85、274.87±12.98和281.79±0.52mg·g-1，各组之间差异不显著(P＞0.05)。质量比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和1∶10条件下，硫酸化壳聚糖硒的硒含量分别为75.60±3.38、65.18±1.66、59.44±2.43、54.29±3.05和31.60±1.11mg·g-1,质量比高的组显著高于低质量比组(P＜0.05);硫含量分别为213.68±0.97、229.15±0.91、236.87±1.98、232.57±2.52和254.74±2.09mg·g-1，质量比为1∶1组的硫含量显著低于其他各组(P＜0.05)。利用正交试验对单因子试验进一步优化，对硫酸化壳聚糖硒进行结构表征，证实硫酸酯基与硒酯基已经成功结合到了CTS上，并且没有破坏壳聚糖硫酸酯单元上的官能团或者破坏糖环结构。结果表明，硫酸化壳聚糖硒合成的最佳反应条件为:质量比为1∶1壳聚糖硫酸酯与亚硒酸钠，在40℃和pH3.0的条件下反应45min，制备出36.01～39.21mg·g-1硒含量和213.81～232.76mg·g-1硫含量的硫酸化壳聚糖硒。
试验二硫酸化壳聚糖硒对鸡肝细胞抗氧化功能的影响
本试验采用胶原酶灌注消化法分离鸡肝脏细胞，用台盼蓝拒染法测定肝细胞即时存活率，以每孔8×105个肝细胞的量接种于牛尾胶原包被的6孔细胞培养板，培养24h后，在培养液中添加0（对照）、0.5、1.5、和5μmol·L-1壳聚糖硒、硫酸化壳聚糖硒、亚硒酸钠（以硒计）和1、3、10mg·L-1壳聚糖硫酸酯、CTS（以硒计对应的CTS量），培养24h后取细胞上清液和细胞裂解液进行总蛋白浓度、抗超氧阴离子(Anti-superoxideanion，O2-)活性、总抗氧化能力（Totalantioxidantcapacity，T-AOC）和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)的测定。结果显示，CTS组和对照组GSH活性显著低于其他各组(P＜0.05)，0.5和1.5μmol·L-1硫酸化壳聚糖硒组显著高于5μmol·L-1组(P＜0.05)，与其他各组差异不显著（P＞0.05）;5μmol·L-1硫酸化壳聚糖硒组上清POD活性与0.5和1.5μmol·L-1亚硒酸钠组差异不显著（P＞0.05），显著高于其他各组(P＜0.05);0.5μmol·L-1亚硒酸钠和1mg·L-1壳聚糖硫酸酯组T-AOC活性显著高于其他各组(P＜0.05)，CTS组和对照组T-AOC活性显著低于其他各组(P＜0.05);5μmol·L-1壳聚糖硒抗超氧阴离子活性显著高于其他各组(P＜0.05)，同浓度的硫酸化壳聚糖硒组与亚硒酸钠组抗超氧阴离子活性差异不显著(P＞0.05);1.5μmol·L-1壳聚糖硒与0.5μmol·L-1亚硒酸钠组CAT活性显著高于其他各组(P＜0.05)，硫酸化壳聚糖硒组CAT活性随硒浓度的增大而增大，亚硒酸钠组CAT活性随硒浓度的增大而减小，对照组CAT活性均显著低于其他各组(P＜0.05)。结果表明，硫酸化壳聚糖硒能显著提高肝细胞中各种抗氧化因子的活性，具有较好的抗氧化作用，效果优于CTS、壳聚糖硫酸酯和壳聚糖硒。
试验三硫酸化壳聚糖硒对GPx1和GPx4mRNA表达的影响
鸡单层原代肝细胞用0、0.5、1.5和5μmol·L-1（以硒计）壳聚糖硒、硫酸化壳聚糖硒、亚硒酸钠和1、3和10mg·L-1（以硒计对应的CTS量）壳聚糖硫酸酯和CTS培养液孵育培养24h，检测肝细胞中细胞性谷胱甘肽过氧化酶(GPx1)和磷脂氢谷胱甘肽过氧化酶(GPx4)mRNA的表达量。结果显示，0.5和5μmol·L-1硫酸化壳聚糖硒组GPx1mRNA表达量显著高于其他组(P＜0.05)，0.5μmol·L-1壳聚糖硒和1.5μmol·L-1硫酸化壳聚糖硒组GPx1mRNA表达量显著高于亚硒酸钠、CTS和空白对照组（P＜0.05），壳聚糖硫酸酯和CTS组GPx1mRNA表达量与对照组差异不显著（P＞0.05）;0.5μmol·L-1硫酸化壳聚糖硒组GPx4mRNA表达量显著高于其他组（P＜0.05），1.5μmol·L-1硫酸化壳聚糖硒组GPx4mRNA表达量显著高于亚硒酸钠组(P＜0.05)，壳聚糖硫酸酯和CTS组与对照组GPx4mRNA表达量之间差异不显著（P＞0.05）。结果表明，硒是影响肝细胞GPx1和GPx4mRNA表达的主要因素，硫酸化壳聚糖硒对GPx1和GPx4mRNA表达量的作用效果优于壳聚糖硒和亚硒酸钠。