[目的]:　　 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所致的医院感染率逐年上升，青素结合蛋白2a(PBP2a)作为其主要耐药机制，已成为全球抗MRSA关注的热点和方向。本研究以重组蛋白PBP2a转肽酶区为靶标，筛选与其高特异性、高亲和力结合的适配子。并利用筛选出的适配子建立快速检测PBP2a的方法。　　 [方法]:　　 1.本研究将PBP2a转肽酶区基因片段通过PCR扩增，构建原核表达载体，经双酶切和测序鉴定后，诱导其在大肠杆菌BL21(DE3) plys中表达，应用Ni-IDA预装柱纯化重组蛋白，用Western-blot鉴定。　　 2.构建长度为96 nt的随机ssDNA文库，两端为18nt的固定序列，中间60 nt为随机序列，库容量大约为1016。以PBP2a转肽酶区为靶标，利用配体指数增强系统进化(SELEX)技术，筛选出针对PBP2a转肽酶区的适配子群。　　 3.将第13轮筛选产物进行扩增、纯化、TA克隆、测序并用相关软件分析其一级和二级结构。　　 4.以胶体金标记适配子，建立斑点渗滤法用于检测适配子的特异性。以地高辛—抗地高辛抗体—碱性磷酸酶系统作为桥连测定不同浓度的适配子与靶蛋白的结合力，通过软件获得解离常数Kd值，进一步鉴定了适配子与靶蛋白的亲和力。　　 [结果]:　　 1.重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，电泳图显示在1000bp处有明显条带，测序结果基本与基因库登录的目的片段序列相同，无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，在分子量38KD处均可见一新生蛋白条带，与PBP2a转肽酶区的分子量相吻合，说明已成功诱导了PBP2a转肽酶区蛋白。　　 2.随着筛选轮数的增加，PBP2a与ssDNA富集库的结合力也显著增高。13轮后结合力从最初的2.9％上升至40.4％，并维持一个稳定状态。　　 3.第13轮产物进行克隆测序，利用ClustalX和Mega5软件分析序列的一级结构，显示63个测定序列中有四对序列几乎完全一致。利用RNA structure4.3软件模拟适体的二级结构，发现序列的二级结构以茎环、发夹、G-四聚体为主，各家族、各序列出现的茎环结构数目不等，且各家族在茎环的大小和位置存在差别。　　 4.胶体金标记适配子斑点渗滤法检测适配子的特异性，结果显示筛选出的适配子具有较高的特异性。以地高辛—抗地高辛抗体—碱性磷酸酶系统作为桥连测定了不同浓度适配子与靶蛋白的结合力，通过软件分析，适体与PBP2a的解离常数Kd值可低至31.75nM。　　 [结论]:　　 本研究构建原核表达载体，成功表达出PBP2a转肽酶区蛋白。运用SELEX技术，经过13轮，筛选到针对PBP2a转肽酶区适配子群，建立胶体金标记适配子斑点渗滤法检测适配子的特异性，以地高辛—抗地高辛抗体—碱性磷酸酶系统作为桥连测定了不同浓度适配子与靶蛋白的结合力，证实所筛选到的适配子具有对PBP2a转肽酶区特异性和高亲和力，为后续的检测方法的建立及对MRSA的抑制性实验建立基础。