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哮喘是一种慢性的,以气道高反应性,气道重塑和慢性炎症为特征的呼吸道功能紊乱。在多种细胞和细胞因子的参与下,呼吸道呈现出对于多种刺激因素的敏感反应。因为可以促发多种神经-炎症反应,且对于气道有重塑作用,NGF被认为是哮喘发病环节中的重要因素。
KinaseD-interacting substrate of220kDa(Kidins220),又称作ankyrin repeatrich membrane spanning protein(ARMS),是蛋白激酶D的底物,是TrkA信号通道中的重要组成部分。ARMS经常与Trk和p75共表达,是现今发现的唯一一种与两种受体相联系的膜蛋白。它可与Trk和p75的跨膜域作用,而TrkA和p75再通过胞外区域相连接,形成一种三元复合物。这种三元复合物的形成,可正经蛋白CrkL,引起MAPK和ERK的持续激活,促进神经元分化和增殖。当ARMS表达增加时,TrkA和p75的联系可以观察到一个显著的减弱。由此可见ARMS与TrkA和p75的关系密切,在调节NGF的作用方面起重要的作用。NGF在哮喘炎症的介导方面起重要作用,TrkA和p75是NGF的两个受体,而它们均与ARMS联系紧密,由此可以推测,ARMS在哮喘炎症的介导中也可能起到重要的调节作用。
对于kidins220/ARMS的研究将进一步阐明NGF参与哮喘发病的神经病理生理机制从而对哮喘新药开发和新疗法确立提供理论基础。
材料和方法：
一、实验材料
1、实验动物
本研究采用雌性BALB/c小鼠80只,由首都医科大学实验动物中心提供,均为雌性,体重在18～25g。
2、主要试剂
兔抗小鼠IL-1β抗体,山羊抗小鼠ARMS抗体均购于SANTA cruize公司;辣根过氧化物酶结合羊抗兔免疫球蛋白和SABC法免疫组化试剂盒均购于武汉博士德试剂公司;β-actin,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二次抗体等均购于北京中山公司;
3、主要仪器
电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;正置荧光显微镜;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机;Motic Images Advanced3.2图象分析系统;
二、实验方法
1、制备哮喘模型.腹腔注射卵蛋白致敏BABL/C小鼠,雾化吸入卵蛋白激发致喘。
2、免疫组织化学检测各组小鼠脾组织ARMS和IL-1β的表达。
3、Western blot方法检测各组小鼠脾组织和外周血白细胞ARMS的表达,检测脾组织IL-1β的表达。
4、图象分析
Westem blot结果用Chemi Imager5500V2.03软件扫描,用Fluor Chen2.0软件定量分析显色带的IDV值。免疫组化结果用Motic Images Advanced3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。
5、统计学处理所有数值均以均数±标准差表示,实验数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较进行t检验。
实验结果：
1、ARMS
免疫组织化学结果显示,哮喘组脾组织ARMS阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于正常对照组(p＜0.05),而NGF阻断组与哮喘组相比,脾组织内ARMS阳性反应产物的平均光密度值明显降低(P＜O.05)
Western blot结果显示:与生理盐水组比较,哮喘小鼠脾组织和外周血白细胞中ARMS目标带的IDV(integrated density value)与内参照IDV的比值明显升高(p＜0.05),而NGF阻断组上述样品中ARMS目的带的IDV与内参照IDV的比值均明显低于哮喘组(p＜0.05)
2、IL-1β
免疫组织化学结果显示,哮喘组脾IL-1β阳性产物的平均光密度值(MOD)显著高于正常对照组(p＜0.05),而ARMS阻断组与哮喘组相比,脾组织内IL-1β阳性反应产物的平均光密度值明显降低(p＜0.05)
Western blot结果显示:与生理盐水组比较,哮喘小鼠脾IL-1β目标带的IDV(integrated density value)与内参照IDV的比值明显升高(p＜0.05),而ARMS阻断组上述样品中IL-1β目的带的IDV与内参照IDV的比值均明显低于哮喘组(p＜O.05)
结论：
1、Kidin220在小鼠正常脾组织和外周血白细胞中有弱表达,且哮喘组明显高于正常组,提示Kidins220可能参与了哮喘发病的炎症细胞动员。
2、阻断NGF后,Kidins220在哮喘小鼠脾组织和外周血白细胞中的表达上调受到抑制,提示Kidins220参与了NGF介导的哮喘发病机制。
3、阻断Kidins220后,IL-1β的表达相对哮喘组小鼠减少,说明Kidins220可能通过调节IL-1β的表达参与NGF介导的哮喘发病机制过程。