牛白血病病毒(Bovine leukemia virus，BLV)属于反转录病毒科(Retroviridae)，丁型反转录病毒属(Deltaretrovims)。该病毒会引起牛淋巴细胞持续性增生，进而导致牛地方流行性白血病的发生。BLV的感染和传播非常普遍，其在中国有较高的流行率。近期，美国学者的研究发现，人类乳腺上皮细胞中存在BLV DNA。随后的研究中发现，BLV DNA在乳腺癌患者的乳腺上皮组织中的阳性率为58.8％(67/114)，显著高于普通人群中的阳性率(28.8％，30/104)。这一发现提示，BLV感染可能与人类乳腺癌发生有潜在的联系。本研究建立了检测BLV前病毒的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法，并基于我国上海、江苏、安徽等地乳腺癌患者的乳腺组织和全血样品，采用多种高灵敏度的方法检测BLV的核酸和抗体，进一步探讨BLV感染与人类乳腺癌发生的相关性。　　一、检测BLV前病毒的LAMP方法的建立　　牛地方流行性白血病有多种诊断方法，包括病理组织学检测、血液学检测、血清学方法以及分子生物学检测。LAMP方法是一种可以在等温条件下扩增核酸的新型技术，具有操作简便，检测成本低的优势。本研究根据GenBank中提供的BLV基因序列，基于其保守区域设计内引物、外引物以及环引物，并建立BLV的LAMP反应体系。在此基础上，通过探索外内引物比例、Mg2+浓度、Bst2.0DNA酶的添加量以及dNTPs浓度，优化LAMP反应参数条件。同时，通过在反应体系中加入钙黄绿素试剂，实现结果的可视化判定。本研究建立了一种能够在25μL反应体系中实现单拷贝病毒核酸检测的BLV LAMP方法，该方法灵敏度优于普通PCR检测方法，并有良好的特异性。　　二、BLV感染与人乳腺癌发生相关性的研究　　有研究发现在人的乳腺上皮组织中能够检测到BLV DNA，并推测BLV可能与人乳腺癌发生存在潜在的联系。乳腺癌的很多高危因素已被证实，但其发生的机理尚未清楚。BLV感染是否会引起乳腺癌的发生，这引起了众多研究者的关注。但截止到目前，并未证实BLV感染与乳腺癌发生存在关联性。　　根据我国BLV的分子流行病学调查，BLV在上海、江苏和安徽有较高的阳性率，所以本研究选择的乳腺癌患者的样品均来自上述三个地区，主要为乳腺组织样品和全血样品。91份乳腺癌患者的冰冻乳腺组织样品，其中66份来自上海健康所，25份来自江苏扬州苏北人民医院;160份乳腺癌患者的全血样品，其中140份由苏州大学第三附属医院提供，20份由安徽淮南朝阳医院提供。本研究采用100份正常人群全血样品作为对照组，该样品来自扬州市苏北医院2013年体检人群，体检人群均被确认为非乳腺癌患者。此外，本研究在安徽、北京、上海和江苏四个地区的奶牛场采集了150份奶牛全血样品。　　本研究为了精确检测人类体内是否存在BLV的核酸和抗体，采用了LAMP、PCR和ELISA多种高度灵敏、特异的检测方法。PCR方法包括:1）1种本实验室建立的FRET-qPCR方法;2）首次报道BLV和乳腺癌相关性的实验室建立的检测方法，包括1种普通PCR方法和5种巢式PCR方法。LAMP方法为本研究所建立的BLV LAMP检测方法。ELISA方法为针对gp51蛋白的商业化ELISA试剂盒。　　奶牛全血样品检测的结果显示，LAMP和FRET-qPCR两种方法检出阳性率为50.0％，检测结果高度吻合。其中，ELISA方法检出阳性率为48.7％，其中4份样品由于奶牛处于BLV感染早期，体内抗体含量未达到ELISA试剂盒检测限。该结果证实上述三种检测方法的可行性。随后，采用这三种方法分别检测人的乳腺组织样品和全血样品，均未在样品中检测出BLV核酸或特异性抗体。此外，本研究使用已报道BLV和乳腺癌相关性的实验室建立的检测方法检测乳腺组织样品的核酸，同样未检测到BLV的核酸。因此，本研究认为BLV感染与上述地区人类乳腺癌的发生不存在直接的关联性。　　综上所述，本研究建立一种快速、灵敏的BLV LAMP检测方法，并研究证实在安徽、江苏、上海等3个地区，BLV的感染与乳腺癌的发生无相关性。由于遗传背景和牛奶消费习惯等方面的差异，不同人群中BLV的感染与乳腺癌发生的相关性还需要进一步的研究。