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基因治疗是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内,使之表达目的基因产物,从而使疾病得到治愈,是现代医学和分子生物学结合而诞生的新技术。基因治疗作为疾病治疗的新手段,正愈来愈受到人们的重视和关注,1989年Rosenberg等首次将基因标记导入黑色素瘤以后,基因治疗更是日新月异的发展。
当前基因治疗研究中急需解决的问题主要表现在两个方面,提供更多可供利用且可持续表达而又可控的导入基因,设计安全高效的定向整合基因转运载体。目前导入基因的手段不理想,基因治疗的基因导入手段要求是高效导入,而且能定向地导入体内某种细胞。已有手段均属低效和无导向性。因此,即使基因有治病效果,若不能有效地导入,效果也会大受影响。已有基因载体主要分为病毒性基因载体和非病毒性基因载体,目前已被用作载体的病毒有腺病毒、反转录病毒、疱疹病毒等。大多数野生型病毒对机体都有致病性,因此需要改造后才能用于人体。已有非病毒性基因载体主要是在一些有机大分子如多聚胺、树状分子,以及一些新型载体如纳米金粒子等。由于非病毒性基因载体的强细胞毒性和低转染效率,使其在实际应用中受到一定限制,但就基因治疗目前的发展趋势而言,非病毒性基因载体正受到人们更多的关注。
我们在研究金属配合物与生物大分子相互作用的过程中,发现一类苯并咪唑金属配合物具有促进DNA凝聚的新性质,早期虽有金属配合物促进DNA凝聚的报道,但仅限于[Co(NH3)6]3+一个配合物。本文中我们合成一系列苯并咪唑配合物并通过筛选选取六个配合物作为研究对象,系统研究几种配合物促进DNA凝聚以及作为潜在基因载体的性质,主要结果如下:
1.合成了两种多苯并咪唑配体:N,N,N’,N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1,10-二氮-4,7-二氧癸烷(EGTB)和1,1,4,7,7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB),并以其为主配体合成了6个金属配合物。
2.利用紫外-可见吸收光谱和溴化乙锭(Ethidium Bromide,EtBr)及Genegreen (GG)染色DNA后荧光猝灭等方法测定了配合物对DNA的亲和性及相互结合的作用方式。结果表明配合物与DNA之间存在良好的亲和性,不同配合物与DNA的亲和性虽有差异但不显著,配合物与双链DNA的亲和性显著强于单链DNA,配合物与DNA亲和性的强弱主要取决于配合物主配体和DNA的结构类型,二者之间通过静电作用、插入作用相结合。
3.利用琼脂糖凝胶电泳研究了配合物促进DNA从松散结构凝聚成凝聚体的性质,通过直角光散射(RALS)、激光动态光散射(DLS)等手段研究了配合物浓度、DNA浓度、pH以及反应时间对配合物促进DNA凝聚的影响,并通过透射电子显微镜(TEM)考察了各种实验条件下生成的DNA凝聚体形貌特征。实验结果表明以上反应条件对DNA凝聚均存在显著影响,只有在pH 6-8范围内配合物才能有效促进DNA凝聚,凝聚体粒径随反应物浓度增加和反应时间增加而增大,不同反应条件下生成DNA凝聚体形貌特征存在显著差异,较小反应物浓度或较短反应时间时生成结构松散且不稳定的凝聚体,控制适当浓度和反应时间可得到结构致密有序且较稳定的纳米级球形凝聚体,较大反应物浓度或较长反应时间得到结构更大的凝聚体。
4.在系统研究苯并咪唑配合物促进DNA凝聚性质后,通过研究不同反应时间内生成的凝聚体形貌特征,结合配合物与DNA相互作用类型的研究结果,我们提出了配合物促进DNA凝聚的反应机制。配合物促进DNA凝聚是一个有序过程,配合物与DNA在静电引力、插入作用的作用下紧密结合,DNA分子在配合物分子间的相互作用下卷曲压缩生成凝聚体,这种作用力主要表现为配合物配体之间的π-π相互作用。
5.通过荧光染色DNA凝聚体的方法,我们观察了DNA凝聚体的跨膜情况。在倒置荧光显微镜下可以清楚的观察到进入细胞内的DNA凝聚体,我们发现只有配合物浓度适中时,配合物的转运效率才能达到最佳;激光共聚焦显微镜实验更加直观和准确的证明配合物可将外源DNA转运至细胞内。通过荧光素酶实验,我们检测了进入细胞内的报告基因表达情况,实验结果表明在苯并咪唑配合物作用下转运至细胞内的外源基因可以有效表达,此类配合物具有作为潜在基因载体的性质和功能。