目的 自然流产是生育年龄妇女最常见的疾患之一，生育年龄的妇女，15～20﹪的临床妊娠以自然流产为结局。流行病学调查研究认为，自然流产是一种多病因疾病。目前已经明确的自然流产的主要原因仍然是胚胎染色体的异常。母体生殖道解剖异常、内分泌异常、免疫紊乱、凝血功能异常、代谢异常等也可能导致流产的发生。但即使经过详细严格的病因筛查，仍有40～60﹪的自然流产病因不明，这使临床上自然流产的有效治疗受到限制，也给临床遗传咨询医生指导患者再次妊娠带来困难，也使自然流产发病机制的研究成为优生遗传和辅助生育技术中的热点之一。多年前，由于检测条件的限制以及人类基因组的复杂性和多样性，人们主要研究流产组织的核型。近年来，随着分子细胞遗传学的进步和人类基因组工程的完成，对流产组织的分析逐渐进入分子水平。研究表明，绒毛组织的免疫相关基因群、血管发生相关基因群、凋亡相关基因群和其他一些未确定的基因与自然流产有关。但是，至今未确定某个基因在自然流产的胚胎停育中有致死突变作用。 妊娠早期，尤其孕8周前，胚胎相对处于低氧环境。因此，任何原因的波动容易造成氧供不足，都可能会加重胚胎缺氧，影响胚胎发育，导致自然流产。目前已知的某些自然流产发病相关因素或因子或许是通过影响胚胎氧供和营养导致胚胎停育的。最能影响胚胎氧供和营养的其实是血液系统的直接改变。国际上一些研究已经揭示了这个可能性，但都没有明确提出，胚胎血液系统的异常可能导致自然流产。而胚胎血红蛋白是胚胎血液系统的重要功能组分，它对胚胎的正常发育是非常重要的，所以胚胎血红蛋白基因(ε、ζ基因)的序列在不同种属和个体发育过程中都非常保守，因为这些基因序列的改变对胚胎发育有致死作用。这两个基因由于自身突变或在微环境干扰下表达异常或失衡，是否是自然流产发病机制的重要途径，是一个值得探讨的课题。通过对胚胎发育的深入理解，并对现有研究文献进行广泛阅读和分析，本研究以胚胎绒毛组织里有核红细胞的ε、ζ基因为目的基因，通过半定量RT-PCR对流产胚胎ε、ζ基因的表达特性进行量化研究，并进一步以荧光定量RT-PCR验证，对胚胎血红蛋白基因在自然流产发病机制中可能的作用进行了探讨，丰富了自然流产的发病学理论，并使我们对正常妊娠的维持有更深入的理解。 资料与方法 1样本收集： 2006年4月至2006年12月共收集35例在我院行人流清宫术的妇女。其中，病例组20例自然流产妇女，自然受孕，平素月经周期规则，末次月经记忆准确，有或无类似病史。B超检查证实宫内妊娠、胚胎停育。按B超提示胚胎停育时的孕周分3组：孕42天～48天(孕6周组)，孕49天～55天(孕7周组)，孕56天～62天(孕8周组)。 对照组15例人工流产妇女，自然受孕，平素月经周期规则，末次月经记忆准确，至少有一次成功妊娠史，B超证实宫内胚胎存活。也按孕周分为3组。 无菌收集人流清宫后的绒毛组织50～100mg，置于TRIzol里-80℃保存。 2提取RNA： 组织放在TRIzol里匀浆后，加入0.2ml氯仿离心，取上清与异丙醇混匀离心，沉淀出的RNA用预冷的75﹪乙醇洗涤离心2次，1‰DEPC水溶解后紫外分光光度计测定样品于260nm和280nm处的吸光度，测定RNA纯度和浓度。 3逆转录反应： 每样本取2ug抽提的RNA用First Strand cDNA Synthesis Kit-Rever Tra Ace-α-TM试剂盒逆转录反应合成cDNA。反应程序按试剂说明书进行。 4半定量RT-PCR： 逆转录所得cDNA进行目的基因和内参基因(GAPDH)的扩增，琼脂糖电泳后EB染色，紫外凝胶成像系统下对凝胶图像灰度值进行分析，对ε、ζ基因相对GAPDH的表达量进行测定。 5荧光定量RT-PCR： 逆转录所得cDNA进行荧光定量PCR扩增ε、ζ基因，测定各样本ε和ζ基因的Ct值，并根据标准回归曲线反应系统自动计算起始cDNA拷贝数。 6统计分析： 应用SPSS 12.0统计软件，用t检验和非参数检验方法对半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR测定的数据进行统计分析，分别以均数、标准差、中位数和四分位数间距进行统计描述。P<0.05认为有统计学差异。 结果 1凝胶图像灰度值观察1.1 15例对照组都能检测到目的基因和GAPDH的表达，且ε、ζ基因和GAPDH的条带灰度值一致性高。 1.2 20例病例组中有16例ε、ζ基因和GAPDH的灰度值不一致。其中，12例样本表现为‘基因条带灰度值明显降低，2例样本表现为ε基因条带灰度值明显降低，2例样本表现为ε、ζ基因条带灰度值都明显降低。 1.3 20例病例组中，孕6周组有1例、孕7周组有1例均未能检测出ζ基因的表达。 1.4 20例病例组中，孕8周组有2例其条带灰度值表现与对照组类似。2半定量测定正常胚胎与自然流产胚胎ε、ζ基因的相对表达量并比较2.1病例组共有2例未能检测出ζ基因表达，孕8周病例组有2个样本条带灰度值的半定量分析与正常组类似。除2个未能检测出ζ基因的表达的样本外，余33个样本均纳入半定量测定的统计分析。 2.2孕6周、孕7周病例组ε基因的相对表达量与同孕周对照组相比，均下降，差异有统计学意义(*P<0.05)。孕8周病例组e基因的相对表达量与同孕周对照组的差异无统计学意义(＃P>0.05)，考虑可能与病例组里有2个样本条带灰度值的半定量分析与正常组类似有关。 2.3孕6周、孕7周和孕8周病例组ζ基因的相对表达量与同孕周对照组相比，均下降，差异有统计学意义(*P<0.05)。3荧光定量RT-PCR测定35例样本ε、ζ基因的表达并比较3.1半定量分析时病例组有2例未能检测出ζ基因表达的样本，在荧光定量RT-PCR中1例可以检测出ζ基因的表达，但cDNA拷贝数很低，只有17.95copy/ul。另外1例始终没有检测出ζ基因的表达。这两个样本没有纳入统计范围。 3.2与同孕周对照组相比，孕6周、孕7周和孕8周病例组ε基因的表达量下降，各组差异有统计学意义(*P<0.05)。 3.3与同孕周对照组相比，孕6周、孕7周和孕8周病例组ζ基因的表达量下降，各组差异有统计学意义(*P<0.05)。 结论 1流产胚胎的绒毛组织可以检测出表达ε、ζ基因的胚胎有核红细胞，造血细胞是胚胎源性，它能提供有关胚胎遗传物质的准确信息。这是直接研究流产胚胎遗传物质非常有意义的胎儿细胞。 2各孕周病例组ε、ζ基因的表达水平下降甚至缺失，与同孕周对照组相比，这种差异有统计学意义。自然流产胚胎ε、ζ基因表达异常可以是基因突变的反映，也可能是体内外环境综合作用使基因转录水平或转录后水平异常导致，这可能是自然流产发病机制中主要的共同通道之一。 3自然流产胚胎η基因的表达水平下降表现比ε基因明显。ζ蛋白对胚胎血红蛋白的氧结合运输功能影响比ε蛋白大，ζ基因可能与自然流产的关系更密切。 4自然流产胚胎中也有ε、ζ基因表达水平如正常胚胎的情况。自然流产是一多病因疾病，胚胎血红蛋白基因表达异常可能是自然流产发病机制中主要的共同通道之一，但不是唯一的通道，可能有其他因素在起作用。 但是，我们不知道这种基因表达量的差异，究竟是基因突变的反映还是体内外环境综合作用使基因转录水平或转录后水平异常导致。假如是转录或转录后调节异常所致，需要进一步研究这些基因在转录和转录后调节的机制。若是基因突变的问题，其致死性突变的性质和其在自然流产胚胎中的频率也有待探讨。此外，ε、ζ基因在其功能水平——蛋白水平上是否有差别。这些问题都有待我们进一步研究，进一步研究这些问题会使我们对正常妊娠的维持有更深入的理解，将来可以结合PGD技术给自然流产的妇女带来福音。