糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以慢性高血糖为特征的,由胰岛素分泌不足或/和胰岛素作用障碍而导致的一组代谢性疾病,按病因分为1型糖尿病(type1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),T2DM更为常见,约占90%。糖调节受损(imparied glucose regulation,IGR)即糖尿病前期,指介于正常血糖与糖尿病高血糖之间的一种高危状态,包括空腹血糖受损(imparied fasting glucose,IFG)和糖耐量减低(imparied glucose tolerance,IGT),IGR一直被视作为糖尿病患病群体的后备军。由于其并发症致残致死率高,T2DM已造成我国乃至全球沉重的疾病负担,如何对其预防与控制已成为全球重大的公共卫生问题。近年来,谷物摄入尤其是全谷类摄入在健康促进与疾病预防方面越来越引起人们的关注。许多前瞻性研究表明增加全谷类食物的消费可降低诸如糖尿病、心血管疾病、肥胖及某些癌症的发病风险。在人群流行病学研究中,通常采用24小时膳食回顾法或食物频率问卷法等调查方法来评估个体食物摄入水平,然而传统膳食调方法容易导致一定程度的系统误差和随机误差,难以精确估算个体的食物摄入水平。另外,全谷类食物因其定义不统一,组成复杂,局限性更为明显,普通消费者难以辨别和评估全谷类产品的种类和数量。因此,膳食生物标志物作为更为客观的膳食评价方法运用于营养流行病学研究显得意义重大。烷基间苯二酚(ARs)作为一组酚类脂质,在小麦和黑麦的体表含量丰富,而在大米、玉米、精制小麦和黑麦以及其他谷物等中含量很低或没有。ARs在食物加工过程中热稳定,约百分之六十(45%-71%)被人体吸收。ARs及其主要代谢产物3,5-二羟基苯甲酸(3,5-dihydroxybenzoic acid,DHBA)和3-(3,5-二羟基苯基)-1-丙酸(3-(3,5-dihydroxyphenyl)-propanoic acid,DHPPA)均能够在人血浆中被检出。在干预实验中,ARs及其代谢产物显著受膳食中全谷类小麦和黑麦摄入量的影响;同样地,观察性研究也显示ARs及其代谢产物与全谷类食物摄入呈现中等强度的正相关关系(r=0.25-0.54)。基于以上特点,诸多文献提议将ARs及其代谢产物作为全谷类食物摄入的生物标志物。考虑到流行病学研究一般采集空腹血液样本,而血浆DHPPA(16.3 h)生物半衰期明显比DHBA(10.1 h)和ARs(5 h)半衰期要长,血浆DHPPA作为全谷类食物摄入的生物标志物应用于人群流行病学研究显得更为合适。鉴于膳食在糖尿病防治过程中作为一种重要的可调控的风险因素,已有相关人群研究报道了全谷类食物摄入(基于食物频率问卷法)与T2DM患病风险之间的关系。截至目前,尚未见ARs代谢产物DHPPA作为全谷类食物摄入的生物标志物与T2DM、IGR患病风险之间关系的研究报道。因此,本研究基于病例对照设计,拟以新诊断T2DM、IGR和正常血糖的对照个体为研究对象,探讨血浆ARs代谢产物DHPPA与T2DM、IGR患病风险的关系。本研究主要内容分为三部分:第一部分高效液相色谱串联质谱定量检测人血浆中烷基间苯二酚代谢产物目的:建立一套高灵敏度、高通量、预处理简便的高效液相色谱-质谱联用方法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS),实现对人血浆中ARs代谢产物DHPPA的准确定量分析。方法:本研究应用Shimadzu 20A高效液相色谱系统串联AB Sciex 4500离子阱质谱仪对血浆DHPPA进行靶向定量检测分析,离子源为电离子喷雾(ESI)。我们对质谱参数、色谱参数以及样品预处理条件分别进行了优化以期达到最佳灵敏度和分离效果并使样品预处理尽量简单。最后,根据欧洲药品管理局生物分析方法验证指南对本分析方法进行全面的方法学验证。结果:经质谱和液相参数优化后,分析物DHPPA和内标丁香酸在负模式下进行多反应监测,优化后的离子对(m/z)分别为181.1/95和196.9/121;色谱分离采用BETASIL Phenyl分析柱(2.1 mm×150 mm,3μm),并以乙腈-0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。进样量被设定为5μL。样本预处理经酶解后以乙腈为沉淀剂进行蛋白沉淀法处理。方法学验证显示分析物DHPPA和内标丁香酸在相应保留时间上不存在内源性干扰。DHPPA校正曲线表现出良好的线性(r~2=0.9997),定量下限(lower limit of quantification)为0.4 ng/mL。在四个不同浓度水平下,质控样本的日内和日间精确度(relative error,RE)、精密度(relative standard deviation,RSD)均小于10%。DHPPA提取回收率介于87.95%-94.19%之间,内标校正后的基质效应介于102.88%-108.84%之间。稳定性试验显示,血浆样品在室温放置24 h、-80°C冻存1年以及样本反复冻融3次的条件下,血浆DHPPA均表现出良好的稳定性。结论:本研究建立的LC-MS/MS方法具有灵敏度高、定量准确、分析时间短、样本预处理简便等特点,为流行病学大规模生物样本检测提供了便利。第二部分血浆烷基间苯二酚代谢产物与谷物膳食纤维摄入的相关关系及其重现性验证目的:探究人血浆ARs代谢产物DHPPA浓度与谷物膳食纤维摄入量的相关关系,并对空腹血浆DHPPA浓度进行重现性验证。方法:根据自愿原则并按照制定的纳入排除标准共招募65名健康志愿者。本研究对志愿者在间隔四周期间进行前后两次膳食调查并同期采集两次静脉血液,所有志愿者同意在研究期间保持与之前一致的饮食习惯。个体的食物摄入评估采用三天膳食记录法,调查时间定为周四、周五以及周六连续三天。志愿者的基本信息通过问卷调查的方式获取,身高、体重、腰臀围与血压等指标则由受过专业培训的工作人员测量获取。血浆DHPPA浓度通过已建立的LC-MS/MS方法进行定量检测分析。结果:(1)本研究共招募65名志愿者,其中2名志愿者事出有因中途退出,另有3名志愿者因三天膳食记录的每日能量摄入差异巨大(SD>600)而被剔除,最终本研究纳入研究对象60名,其中男性42名,女性18名。研究对象平均年龄24.72岁,BMI为21.80 kg/m~2。每日谷物膳食纤维和总纤维摄入分别为3.43g/d和9.50 g/d。(2)膳食调查第一次和第二次谷物纤维摄入与同期血浆DHPPA浓度均呈现显著正相关,其Pearson相关系数分别为0.432和0.413,P值均小于0.01。即使校正了协变量性别、年龄和BMI后,前后两次膳食调查的谷物膳食纤维摄入与血浆DHPPA浓度的相关关系依然显著。另外,本研究观察到血浆DHPPA作为谷物膳食纤维摄入的独立预测指标,能够解释其17%的变异(adjusted r~2=0.173;P=0.001)。(3)本研究第一次和第二次血浆DHPPA浓度的几何平均值(95%CI)分别为13.44(11.52-15.68)nmol/L和13.20(11.11-15.69)nmol/L,两次测量结果没有显著的统计学差异。前后两次血浆DHPPA浓度的组内相关系数为0.486(95%CI=0.142-0.692)。结论:本研究表明血浆ARs代谢产物DHPPA与谷物膳食纤维摄入量具有显著相关性,并且血浆DHPPA浓度呈现出较好的重现性。第三部分血浆烷基间苯二酚代谢产物与2型糖尿病、糖调节受损的关联性研究目的:探讨血浆ARs代谢产物DHPPA作为全谷类食物摄入的生物标志物与T2DM和IGR患病风险的关系。方法:本课题基于病例对照研究设计,根据世界卫生组织(world health organization,WHO)1999年推出的诊断标准,将研究对象分为T2DM组、IGR组和正常对照组。所有病例来源于2012年至2015年期间在武汉市华中科技大学附属同济医院内分泌科进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)的人群,同时对照组个体是从在同济医院进行常规体检的人群中招募。病例和对照根据性别和年龄(±5岁)进行频率匹配。研究对象基本信息通过问卷调查的方式获取,人体测量指标则由专业工作人员进行测量获取。血浆DHPPA浓度通过已建立的LC-MS/MS方法进行定量检测分析。结果:本研究共纳入研究对象3239名,其中新诊断T2DM病人1060名,新诊断IGR病人736名和正常对照个体1443名。T2DM组、IGR组和正常对照组的血浆DHPPA水平分别为9.06(5.30-15.78)、9.66(5.82-15.62)和10.21(6.56-17.98)nmol/L。T2DM组和IGR组血浆DHPPA浓度明显低于正常对照组(P<0.005)。多因素Logistic回归分析结果表明,在调整年龄、性别、BMI和糖尿病家族史后,与最低四分位的人群相比,血浆DHPPA水平位于最高四分位的人群患T2DM和IGR的OR(95%CI)值分别为0.57(0.45,0.73)和0.66(0.50,0.85),进一步校正其他混杂因素并没有实质性地影响研究结果。在各亚组分析中,血浆DHPPA水平与T2DM的患病风险同样呈现出一致的负关联关系。结论:本研究表明血浆ARs代谢产物DHPPA浓度与T2DM、IGR患病风险呈现显著的负关联关系。