猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,常给养猪业造成巨大的经济损失。CSFV对免疫细胞有高度的亲嗜性,可入侵宿主免疫系统,并造成免疫系统功能障碍。树突状细胞(Dendritic cells,DC)是体内功能强大的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC),是机体免疫反应的始动者,在特异性免疫中起着十分重要的作用,与病原微生物感染发病和机体免疫预防都有着十分紧密的关系。NF-κB(nuclear factor-kappa B)是一种广泛存在于各类细胞中重要的转录调节因子,它调节细胞的基因转录,在机体的免疫和炎症反应过程中起着重要的调节作用,与疾病的发生、发展关系密切。另外,NF-κB还影响着细胞的生长、分化,在机体发育生长过程中起着重要作用。根据DC和NF-κB在机体免疫应答与疾病发生中的重要作用,本研究主要探讨CSFV感染对DC、PK-15细胞的功能及其NF-κB信号通路的影响,为揭示CSFV的致病机制及CSF的防控提供新的思路。　　 研究共分三部分,第一部分主要研究CSFV感染对未成熟DC功能的影响:第二部分主要研究CSFV感染DC后对其NF-κB信号通路活性的影响;第三部分以猪源传代细胞系PK-15为模型,主要研究CSFV感染与PK-15细胞NF-κB信号通路的关系及其活性影响。　　 第一部分:无菌条件下采集健康仔猪的外周血,用淋巴细胞分离液体外分离获得猪外周血单核细胞,联合应用重组猪源GM-CSF和IL-4,在体外成功诱导出猪外周血单核细胞来源的、细胞膜表面具有典型树枝状突起的DC。用MOI=1量的CSFV GXW-07株感染未成熟DC(细胞表面低表达MHC-Ⅱ分子和CD172a分子,高表达CD1分子),48h时,收集细胞,用透射电镜进行观察,结果在DC的细胞浆内检测到了大小约40-50nm的病毒样粒子,显示CSFV GXW-07株对DC具有感染性。　　 为了研究CSFV GXW-07株感染对DC功能的影响,将CSFV GXW-07株以MOI=1的量感染未成熟DC,同时设Hi-GXW-07(heated-inactivated GXW-07,热灭活病毒)刺激DC对照、LPS刺激(阳性刺激)DC对照和空白DC对照。分别在作用48h后收集细胞,应用流式细胞术对各组DC表面分子MHC-Ⅱ(SLA-Ⅱ-DR)、CD1和CD172a表达情况进行检测。结果显示,CSFV GXW-07株感染DC后其表面分子MHC-Ⅱ的表达率为6.97％,Hi-GXW-07刺激和LPS刺激DC表面分子MHC-Ⅱ的表达率分别为24.91％和23.94％,而空白DC对照表面分子MHC-Ⅱ的表达率为7.76％,与空白DC对照相比,CSFV GXW-07株感染DC不能上调其表面分子MHC-Ⅱ的表达。DC感染CSFV GXW-07株后其表面分子CD1的表达率为45.31％,Hi-GXW-07刺激、LPS刺激DC和空白DC对照表面分子CD1的表达率分别为50.40％、70.96％和65.44％,由此可知,CSFV GXW-07株感染DC后可下调其表面分子CD1的表达。CSFV GXW-07株感染DC后其表面分子CD172a的表达率为88.01％,Hi-GXW-07刺激DC、LPS刺激DC和空白对照DC表面CD172a分子的达率则分别为71.46％、55.06％和60.04％,由此可知,CSFV GXW-07株感染DC后可上调其表面分子CD172a的表达。　　 为了进一步研究CSFV GXW-07株感染对DC的影响,将CSFV GXW-07株感染未成熟DC(MOI=1),同时设Hi-GXW-07刺激DC对照、LPS刺激(阳性刺激)DC对照和空白DC对照。分别在作用48h后收集细胞,抽提细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)对编码DC相关表面分子(CD80、CD83、CD86)以及细胞因子(IFN-α、IFN-γ、IL-10、IL-12和TNF-α)的mRNA水平进行检测。结果显示,CSFV GXW-07株感染未成熟DC,不影响其CDS0、CD83、CD86、IFN-α、IFN-γ、IL-12和TNF-α的mRNA水平(P＞0.05),但可以显著上调IL-10 mRNA的水平(P＜0.01)。分别取CSFV GXW-07株感染DC后6、12、24、36、48h时的细胞培养上清,用ELISA检测IFN-γ和IL-10的含量。结果显示,在CSFV GXW-07株感染DC的细胞培养上清中检测不到IFN-γ,但IL-10在细胞上清中的浓度最高可达80.100 pg/mL,与空白DC对照相比,IL-10的表达显著升高(P＜0.01)。　　 第二部分:为了探讨CSFV感染与DC NF-κB信号通路的关系,将CSFV GXW-07株感染未成熟DC(MOI=1),同时设Hi-GXW-07刺激DC对照、LPS刺激(阳性刺激)DC对照和空白DC对照,分别进行如下检测:DC感染CSFV GXW-07株48h时,收集细胞,分离细胞核蛋白,EMSA(Electrophoretic mobility shift assays)检测。结果显示,感染CSFV GXW-07株DC的核蛋白经过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后,不出现特异的NF-κBp65蛋白-DNA结合条带:DC感染CSFV GXW-07株后12、24、48h,分别收集细胞,间接免疫荧光检测。结果显示,CSFV GXW-07株感染DC后,NF-κB信号通路活性关键蛋白p65主要定位于DC的胞浆,其核转位几乎检测不到:DC感染CSFV GXW-07株后12、24、48h,免疫组化检测感染细胞NF-κB p65及其抑制蛋白IκBα的蛋白水平,Western blot结果显示,感染DC中NF-κB p65蛋白水平保持稳定,且NF-κB的抑制蛋白家族成员IκBα也没有发生降解。由此可知,CSFVGXW-07株感染未成熟DC后不能诱导其NF-κB信号通路的活化。　　 第三部分:用CSFV Thiverval株和GXW-07株以MOI=1的量分别感染PK-15细胞,同时设TNF-α刺激PK-15细胞对照(阳性对照)和空白细胞对照,分别于感染后不同时段进行如下检测:PK-15细胞感染CSFV Thiverval株、GXW-07株后48h,分离细胞核蛋白,EMSA检测。结果显示,CSFV Thiverval株、GXW-07株感染PK-15细胞后均不影响其NF-κB的DNA结合活性;PK-15细胞感染CSFV Thiverval株、GXW-07株后1、3、6、12、24、48h,分别收集细胞,激光共聚焦检测。结果显示,CSFV Thiverval株、GXW-07株感染均不诱导其NF-κB p65的核移位;PK-15细胞感染CSFV Thiverval株、GXW-07株后1、3、6、12、24、48h,Western blot检测感染细胞NF-κB p65及IκBα的蛋白水平,结果显示,CSFV Thiverval株、GXW-07株感染均不改变p65和IκBα的表达。同时用实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)对编码p65蛋白的mRNA进行检测。结果显示,p65 mRNA水平没有明显改变,其结果与蛋白检测一致,由此可知,CSFV Thiverval株、GXW-07株感染PK-15细胞后均不能激活其NF-κB信号通路。Q-RT-PCR检测同时发现,CSFV Thiverval株感染PK-15细胞可显著下调其IFN-α和凋亡相关因子caspase-3 mRNA的表达水平(P＜0.01),GXW-07株感染K-15细胞则可显著上调其caspase-3 mRNA的表达水平(P＜0.01),但对IFN-α mRNA表达水平没有影响。为了进一步确认CSFV感染对PK-15细胞凋亡的影响,用Annexin-V/PI双标法对CSFV Thiverval株、GXW-07株感染48h时PK-15细胞的凋亡状况进行检测,结果显示,感染CSFV Thiverval株、GXW-07株后PK-15细胞的凋亡率分别为35.83％和35.93％,空白对照细胞的凋亡率为4.66％,与空白DC对照相比,CSFV Thiverval株、GXW-07株感染使PK-15细胞的凋亡率有所增加。　　 综上所述,本研究主要得出如下结论:(1)CSFV GXW-07株感染未成熟DC后,不能诱导DC的成熟,但可选择性的上调其共刺激分子CD172a和细胞因子IL-10的表达,由此推测,CSFV可能通过抑制DC的成熟、上调免疫抑制性分子CD172a和IL-10的表达来降低宿主的免疫反应,从而导致CSFV的持续感染或造成机体的免疫功能低下。(2)CSFVGXW-07株感染DC后,不能使DC的NF-κB信号通路活化,由此提示,CSFV可能通过抑制NF-κB信号通路的活化,降低宿主细胞的抗病毒效应,造成持续感染。(3)CSFV Thiverval株和GXW-07株感染PK-15细胞,均不能有效激活PK-15细胞的NF-κB信号通路,但都可使PK-15细胞的凋亡率有所增加。由此提示,CSFV通过抑制NF-κB信号通路的活化,可能导致CSFV感染细胞的凋亡率升高,不利于病毒在细胞中复制,使病毒低水平存在,导致临床CSFV的持续隐性感染。