论文部分内容阅读
坛紫菜（Porphyra haitanensis）,主要分布在福建、浙江和广东沿岸,是我国特有的大型经济海藻之一,具有高蛋白、高纤维、低热值、低脂肪的特点,含有丰富的氨基酸（包括8种必需氨基酸）,是生物活性肽的理想蛋白源。本文首先对不同采收期坛紫菜进行营养成分分析和品质评价;其次,采用响应面（response surface methodology,RSM）优化超声波提取坛紫菜蛋白的工艺条件,测定蛋白的基础特性;再次,采用RSM优化酸性蛋白酶酶解坛紫菜蛋白的工艺条件,测定酶解产物体外抗氧化活性;最后,利用凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography,GFC）对不同分子量的坛紫菜蛋白抗氧化肽进行分离富集,探讨高抗氧化活性组分对H2O2诱导的人肝癌HepG2细胞的氧化损伤的修复作用,同时借助液相色谱/电喷雾质谱（LC/ESI/MS）技术对坛紫菜高抗氧化活性肽的一级结构予以鉴定。研究其对具体结果如下:1.以不同采收期坛紫菜为原料,测定其基本营养成分、氨基酸、脂肪酸和无机元素,并对营养价值进行了评价。结果表明,坛紫菜蛋白质含量、总糖含量、粗纤维含量、灰分含量和脂肪含量随着采收期的变化均有显著性的差异（p<0.05）。坛紫菜中共检出17种氨基酸,其中末水紫菜氨基酸含量最高,其值为34.62g·100g-1,二水紫菜含量最低,其值为30.87g·100g-1。以氨基酸评分和化学评分为标准,蛋氨酸（DL-Methionine,Met）均为第一限制性氨基酸。头水紫菜共检出16种脂肪酸,四水和末水紫菜检出14种脂肪酸,二水和三水紫菜检出13种脂肪酸。不同采收期的坛紫菜均测得12种无机元素,包括Na、Mg、K、Ca等常量元素和Mn、Fe、Cu、Zn、As、Se、Cd、Pb等微量元素。2.以坛紫菜为原料,通过单因素试验确定合适的因素水平,以Box-Behnken中心组合实验设计及RSM优化间歇式超声波提取坛紫菜蛋白质工艺,并对其基础特性进行检测分析。结果表明,在超声功率为1278w、超声发出时间为6s、超声全程时间为52min的条件下,坛紫菜蛋白质得率最高为61.20%。基础特性结果表明,坛紫菜蛋白的等电点（isoelectric point,pI）为4.2,坛紫菜蛋白质的紫外最大吸收波长为260nm,坛紫菜蛋白质的主要分子质量为56.35、20.45、16.52kDa,蛋白质氨基酸种类齐全,谷氨酸（glutamic acid,Glu）、天冬氨酸（L-AsparticAcid,Asp）和丙氨酸（Alanine,Ala）含量最高,必需氨基酸质量分数为40.29%,非必需氨基酸质量分数为59.71%,必需氨基酸和非必需氨基酸的比例为0.675。3.通过单因素试验,Box-Behnken中心组合实验设计及RSM优化了酸性蛋白酶水解末水坛紫菜蛋白工艺,并测定了不同水解时间的酶解产物其体外抗氧化活性。结果表明,当水解时间为4h、底物质量浓度为2 g/100 m L、加酶量为4240（U/g）、pH值为3.7、温度为54℃的条件下,水解度（degree of hydrolysis,DH）可高达11.40%。此外,通过调节水解时间以控制DH,探讨DH与酶解产物抗氧化活性的关系。研究表明,DH为11.40%时,酶解产物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除活性最强,其半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.68 mg/mL。4.采用GFC层析柱对不同分子量的末水坛紫菜抗氧化肽进行分离富集,纯化后末水坛紫菜抗氧化肽表现出较强的抗氧化活性,其浓度为1mg/mL时对DPPH自由基清除率为73.32%,羟自由基清除率为30.15%。借助LC/ESI/MS技术对坛紫菜高抗氧化活性肽的一级结构予以鉴定,得到1种氨基酸序列为Asp-Lys-Ser-Thr,分子量为449Da的4肽。建立H2O2诱导人肝癌HepG2细胞的氧化应激模型,证实坛紫菜高抗氧化活性肽对H2O2诱导的人肝癌HepG2细胞的氧化损伤具有修复作用,增强超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）的酶活,降低脂肪氧化产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量,且呈现剂量依赖性。