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以来源丰富的木质纤维素为原料的第二代生物乙醇,已经成为当前研究者的主要研发热点。利用高温菌进行纤维素乙醇发酵具有诸多潜在优势。阻断其与乙醇代谢途径竞争碳源和还原力的乳酸和乙酸生成途径的代谢工程方法是当前提高乙醇产率的主要策略。但由于ldh和pta在高温厌氧菌中的生理功能及代谢调控机制尚不清楚,导致该策略的改进缺乏理论指导,工程菌株的乙醇产量仍然很低。本文以实验室分离保存的嗜热厌氧菌Rx1为出发菌株,在敲除乙酸生成途径的关键酶基因ack的基础上,分析了ack对碳中心代谢关键酶的活性、基因表达和代谢通量水平上的影响,研究了ack对糖酵解和乙醇发酵途径的代谢调控作用,再通过分析突变株细胞内NADH/NAD+、ATP/ADP比率与代谢调控作用的关系,进而探索了ack基因的代谢调控机理。获得了如下结果:1.T.calidiforntis Rx1乙酸激酶基因的敲除以实验室筛选到的高效降解半纤维素产乙醇的革兰氏阳性严格厌氧嗜热菌T.calidiforntis Rx1为研究对象,首先构建了用于敲除乙酸激酶的重组载体pBSkpa,并将其导入T.calidifornti Rx1细胞中,并初步筛选到4株突变菌株。分别通过PCR验证、测序验证和代谢产物分析验证成功得到一株生长速率较快的工程突变菌株Δack。并且通过传代培养实验验证了突变株的遗传特性的稳定性。2.乙酸激酶基因的敲除对T.calidiforntisRx1生长和发酵的影响对Δack突变菌株进行生长特性分析发现其延滞期增长,野生菌株接种2h后就进入指数生长期,而突变菌株要进过4h的适应才能快速生长。野生菌株乙醇耐受性为4%,而突变菌株乙醇耐受性增加至6%。分别对T.calidiforntis Rx1和Δack突变菌株进行发酵实验,以葡萄糖、纤维二糖、木糖和玉米芯酸水解液为底物,结果与野生菌株相比,突变菌株生长减慢,细胞的干重都有所降低,且底物消耗量增加,但是乳酸或乙醇的得率显著提高;当以纤维二糖为底物时,突变菌株的乙醇产量达3.60 g/L,得率为0.55 g/g,远高于突变菌株对其它底物的产量;以玉米芯水解液为底物时,突变菌株的乳酸产量高于野生菌株,而且野生菌乳酸、乙醇的产量都高于以木糖为底物时的产量。3.乙酸激酶基因的敲除对T.calidiforntis Rx1碳中心代谢的影响分析ack基因的敲除对代谢途径关键酶在基因转录水平、蛋白质水平上的影响,解析目的基因ack对宿主细胞的代谢调控作用。对T.calidiforntis Rx1中心碳代谢途径中的关键酶基因进行实时荧光定量PCR,结果显示除pta基因和NADH脱氢酶基因上调表达,突变菌株的其它关键酶基因的表达量都低于野生菌株。关键酶的酶活分析发现糖酵解途径的限速酶GK及POR、LDH的酶活增加,PTA、ACK的酶活显著降低,这也是乳酸含量升高的原因。4.乙酸激酶基因的敲除对Rx1菌株能荷水平和氧化还原水平的影响通过测定野生型和突变菌株细胞内NADH、NAD+、ATP、ADP的浓度,分析ACK依赖性ATP生成途径的缺失对细胞内氧化还原水平(NADH/NAD+)和ATP/ADP的影响。结果显示在细胞的指数生长期,突变菌株细胞内的ATP/ADP的比值稍低于野生菌株菌株,而稳定期野生菌株细胞内的ATP/ADP比值高于指数生长期细胞,而突变菌株则是稳定期的ATP/ADP比值低于指数生长期,ATP/ADP的比值对于细胞的生长有调节作用,高比值有利于细胞的生长。对于细胞内氧化还原水平NADH/NAD+,野生菌株生长期NADH/NAD+比值与稳定期相一致,而突变菌株则是稳定期细胞NADH/NAD+比值高于生长期,而突变菌株的代谢产物乳酸、乙醇产量高于野生菌株,这可以说明NADH/NAD+比值升高有利于碳源流向乳酸、乙醇等产物。