论文部分内容阅读
大肠杆菌O157：H7的一个重要的致病作用是它具有粘附到宿主细胞的能力,在粘附过程中菌毛起着重要的作用.根据Genebank发表的大肠杆菌O157：H7菌株EDL933基因组序列分析,ycbR基因可能是菌毛基因ycbQ的分子伴侣基因,与菌毛的形成有关,然而它的确切功能及在粘附过程中所起的作用还不太清楚.为了表达ycbR基因并进一步研究其功能,该试验根据报道的大肠杆菌O157：H7菌株EDL933的ycbR基因序列设计了引物,在上游引物的5端加上NcOI的酶切位点CCATGG和起始密码子ATG,下游引物5端加上XhoI酶切位点CTCGAG,以大肠杆菌O157：H7国内分离株97094的DNA为模板,经PCR反应扩增出长度为710bp的DNA片段.回收纯化PCR产物,并用限制性内切酶NcoI和XhoI消化.采用碱裂解法提取载体质粒PET28a（+）,用NcoI和XhoI双酶切.回收纯化酶切后的载体质粒PET28a（+）并与回收纯化的NcoI和XhoI双酶切的PCR产物连接,连接产物转化入用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌菌株DH5α.转化菌在含Kan抗生素的LB固体培养基上,37℃培养12-16小时.挑取重组菌培养,提取重组质粒,经PCR和限制性酶切鉴定,表明确有与目的基因大小一致的基因片段插入;测序表明扩增的目的基因与Genebank发表的EDL933菌株的ycbR基因序列完全一致,从而成功构建了含有ycbR基因的重组质粒PET28a（+）DE.将含有ycbR克隆的重组质粒PET28a（+）DE转化大肠杆菌高表达菌株BL21,经液体LB（含Kan抗生素）培养,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,结果表明ycbR基因在表达菌株中获得高效表达,且分子量大小约27KD与预期一致.