背景与目的：　　死亡时间(time of death)也称死后间隔时间(Postmortem Interval,PMI)系指尸检时距个体死亡时的时间间隔。准确地推断PMI，对于寻找案件侦查线索、锁定侦查范围、确定/排除犯罪嫌疑人和案件性质，重现作案过程及审判等方面均有重要证据价值。因此，准确推断PMI历来是法科学研究与法医鉴定实践中重要课题之一，也是法医学的历史性难题。　　生物力学已在医学领域得到了广泛应用，形成了前景广阔的医学生物力学。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后的新近学科，定量地探讨病变组织诊断和疗效的代谢标志物。基于尸体组织“回归自然”的进行性自溶腐败和风化的死后变化，必然存在时序性生物化学物质降解及其相应生物力学性状变化的原理，利用生物力学和代谢组学的理论和技术，本课题组前期研究了空气中和水中大鼠不同PMI的尸体软组织生物力学性状时序性变化、不同年龄和性别软组织生物力学性状变化，以及放血处死家猪肝、小肠、主动脉、皮肤等组织生物力学和生物化学性状时序性变化规律，证实了组织生物力学性状、生物化学指标与PMI之间存在明显的相关性。　　本研究系在这些前期研究基础上，探讨甲醛和酒精固定的不同PMI骨骼肌的组织生物力学性状，及其固定-萃取液中生物化学物质成分含量变化规律，结合骨骼肌组织大体形态、显微组织结构和计算机病理图像处理等技术，量化分析骨骼肌组织生物力学性状和生物化学物质变化与组织形态结构的构效关系，及其多种量化指标分别地和组合地推断PMI的科学性和可行性。　　材料与方法：　　1实验动物组织来源　　体重120-150 kg成年家猪的骨骼肌组织（里脊肉）组织10批次，保湿储运。实验室内按生物力学和生物化学实验需求，处理后分别放入广口瓶或离心管等特定容器，置于恒温25℃/恒湿100％人工气候箱内。以家猪死后5 h为第一时间点，记为0 h。　　2组织形态学观测　　⑴每间隔12 h观测大体变化并记录各时间点家猪肌肉块色泽、质地、形态、腐败程度、气味等指标变化情况。应用数码相机和Photoshop CS5.0软件读取各时间点骨骼肌组织照片颜色的RGB值。　　⑵在0-138 h间，每隔12 h，取骨骼肌组织检材，分别平行和垂直肌肉纤维方向切取，常规制作组织石蜡切片，分别HE和P-VB特殊染色方法染色，使用Leica Application Suite Version4.0.0图像分析系统，观测记录各时间点骨骼肌组织形态结构的时序性变化情况。采用Image-Pro Plus6.0病理图像量化分析系统，量化分析骨骼肌组织镜下肌纤维密度、直径、面积以及光密度等指标。　　3取材规范　　采用“六定”取材规范：　　⑴定时：生物力学实验组分别于死后0-132 h时间段内每隔12 h取材，共12个时间点组。生物化学实验分别于死后0-192 h时间段内每隔12 h取材，共18个时间点组；　　⑵定位和定向：取家猪脊柱肌的背侧肌组部位骨骼肌组织(里脊肉)，平行和垂直肌肉纤维方向切取立方体组织块；　　⑶定液和定比：按常规蒸馏水与分析纯甲醛原液按9:1配制4%甲醛溶液，常规蒸馏水与分析纯乙醇原液按2:8配置80%乙醇溶液。生物力学试件和生物化学检材均按检材与固定液溶剂质量-体积比1:10固定，固定时间为72 h；　　⑷定形：生物力学试件预取2×2×2 cm3检材，固定后平整切取1×1×1 cm3正方体试件，生理盐水冲洗和纱布保湿。生物化学组以质量为准切相应大小立方体状组织。　　4生物力学检测　　每时间组3-6个试件，分甲醛固定和乙醇固定两组，采用便携式生物力学检测仪(KDI-0.2,凯强利)，沿肌纤维纵向压缩试件，自动监测记录：力-变形曲线、应力-应变曲线、极限载荷、平均力、断裂力、弹性模量、屈服应力、屈服应变等力学指标。　　5生物化学检测　　各时间点骨骼肌组织固定72 h后，单层快速定性滤纸过滤（Φ12.5 cm，沃华），分别取甲醛和乙醇的固定-萃取液作为生物化学检材：　　⑴观察拍照记录各时间点固定-萃取液大体颜色变化；　　⑵MP220型pH计测定固定-萃取液的酸碱度；　　⑶采用铬钴比色法测定固定-萃取液的色度；　　⑷茚三酮染色法，紫外-可见分光光度计（TU-1901，普析通用）全波段扫描，分析固定-萃取液中α-氨基类物质浓度变化。　　6统计分析　　采用SPSS16.0、GraphPad Prism5.0和Excel2007等统计软件对所得数据进行分析，各组数值以均数±标准差((x)±s)表示，采用独立样本t检验、单向方差分析(One-way ANONA)，相关回归分析和多元回归分析，统计学检验的定义P<0.05为差别具有统计学意义，P<0.01为差别具有高度统计学意义。　　结果：　　1大体形态改变　　新鲜骨骼肌组织色泽随时间逐渐变化，呈半透明状红色有光泽-暗红色无光泽-斑片状黄色区-大片金黄色；肌纤维纹理逐渐模糊消失；质地由柔韧富弹性逐渐软化。48 h开始出现斑点状液化，逐渐扩大成片状液化区，再逐步整体泥化、液化。72-168 h疏松膨胀，180 h后完全液化，呈稀糊状。36 h开始发臭，逐渐加强，84 h时臭味最著，再逐渐减弱，114 h后臭味不明显。　　36-120 h的R、G、RGB三者均值随PMI延长呈增大趋势(p<0.05)，120 h后变化趋势不明显(p>0.05)；B值36小时后变化趋势不明显。因此，骨骼肌颜色变化推断PMI的窗口期为36-120 h，各颜色值与PMI相关回归方程分别为：PMI=0.884R+75.211， R2=0.9683，PMI=0.8368G+44.383，R2=0.9641；PMI=0.657RGB+55.972，R2=0.9486。多元回归分析：窗口期为36-120 h，PMI=0.872G-0.589R-0.364B+21.728，R2=0.862。0-36 h各时间点骨骼肌颜色R、G、B、RGB四通道均值，随PMI延长呈减小趋势，曲线拟合无意义（均p>0.05）。　　2组织形态学及病理图像量化分析　　HE和P-VB特殊染色观察，随着PMI延长，肌细胞逐渐肿胀、断裂、碎裂、溶解、融合；间质结缔组织胶原纤维逐渐肿胀、不规则断裂、溶解。48 h前，肌纤维间隙较大，之后肌间隙逐渐缩小、纤维逐渐融合；96 h后，肌纤维大片融合；86 h后HE和P-VB染色不均。观测各时间点肌纤维面积、平均密度、平均直径、累计光密度。其中纵切面的P-VB染色四个指标变化均呈明显的时序性变化规律，密度窗口期为36-96 h；肌肉纤维面积、直径、累计光密度变化趋势基本一致，窗口期为72-120 h，均与PMI高度相关性（P<0.01）。相关方程为：PMI=0.66X密度-4.312，R2=0.881；PMI=0.236X直径+4.809， R2=0.853；PMI=1.984×10-3X面积+64.126；R2=0.8527；PMI=（1.146E-6） XIOD+6.310， R2=0.8789。横切面两种染色和纵切面HE染色的四种指标均无明显规律。　　3生物力学性状检测　　各时间点试件的极限载荷（最大力）、平均力、弹性模量三个组织生物力学性状参数较稳定，符合总体方差齐性。乙醇和甲醛固定的肌组织生物力学性状随PMI变化趋势相同，但乙醇固定的参数值略大，窗口期内各指标与PMI相关性显著均P<0.05。　　4生物化学检测　　⑴随PMI延长，骨骼肌组织的固定-萃取液颜色逐渐加深，呈无色透明-淡黄色-深黄色渐变。铬钴比色法测定固定-萃取液的色度值：①乙醇固定-萃取液色度推断PMI窗口期为12-120 h，间隔36 h组间差异P﹤0.05，PMI=0.32Chroma+1.808，R2=0.826。②甲醛固定-萃取液色度推断 PMI的窗口期为12-108 h，间隔48 h组间差异 P﹤0.05， PMI=0.28Chroma+1.908，R2=0.895。　　⑵乙醇固定-萃取液PH值呈无前平台期的上升趋势，推断PMI窗口期为0-84 h，之后变化无规律，PMI=4.037PH-23.212，R2=0.922。　　甲醛固定-萃取液PH均值随PMI延长，呈先上升后下降趋势，推断PMI上升窗口期12-48 h和下降窗口期60-120 h。上升窗口期：PMI=3.312PH-11.70，R2=0.837；下降窗口期：PMI=38.061-6.156PH，R2=0.870。　　⑶茚三酮染色的固定-萃取液，Abs570nm呈单一稳定吸收峰，随PMI吸光度逐渐增加，呈时序性上升趋势。①乙醇固定-萃取液推断PMI的窗口期为在48-132 h，间隔36h组间差异性P﹤0.05，PMI=12.860Abs+5.607，R2=0.683。②甲醛固定-萃取液推断PMI的窗口期为在72-156 h，间隔36h组间差异性P﹤0.05，PMI=12.219Abs+6.395，R2=0.839。　　结论：　　1、基于死后组织自溶腐败的时序性变化，骨骼肌组织的单向进行性尸体生物化学降解变化，导致了尸体组织形态学的相应结构变化，构成了尸体组织生物力学变化的物质基础，符合基本的物质理化构效关系原理，可作为综合应用生物力学和生物化学技术检测相关的物质量变和质变的推断PMI的理论依据。　　2、常规甲醛和乙醇固定的骨骼肌，即时固化取材时PMI点的腐败自溶，同时，还可提高组织生物力学性状的时间差和延长其检测时限，提高利用骨骼肌生物力学性状推断PMI的科学性和实用性。检测极限载荷、平均力、弹性模量等生物力学相关指标时序性变化可用于推断PMI。总体上，认为甲醛固定组生物力学推断PMI优于乙醇固定。　　3、常规甲醛和乙醇固定骨骼肌，在即时终止组织自溶腐败的同时，还可兼具组织中死后生物化学变化产物的萃取液作用，检测相关蛋白等生物大分子降解物的种类及其含量变化可以推断PMI。总体上，认为乙醇固定组生物化学推断PMI优于甲醛固定。　　4、两种固定-萃取液的PH值、色度值，大体颜色的RGB值，骨骼肌组织形态体视学等观测指标，也可用于推断PMI，均有各自不同的推断PMI窗口期和优势。　　本项目证实了综合进行常规固定后骨骼肌组织生物力学性状和生物化学指标以及组织形态的量化检测，利用不同指标的窗口期，可相互补充印证地更准确地推断PMI。