日本血吸虫(Schistosoma japonicum)可寄生于多种宿主，引起严重的人兽共患血吸虫病。该病广泛流行于东南亚地区，在我国南方约有6600万人受威胁，将近100万人和超过170万头牛及其他哺乳动物受到感染，严重危害人体健康、影响经济发展。伴随着人类活动的增加，气候、环境及其中间宿主的分布逐渐发生变化，不同地域品系、不同来源的日本血吸虫基因交流频率逐渐增加，使得不同地区分离株间呈现不规律性变异。日本血吸虫的基因组变异研究有助于种下分类、开发地域株特异性分子标记并建立溯源检测方法，对日本血吸虫病防控具有重要的指导意义。　　本论文分为3个部分研究了中国大陆和菲律宾日本血吸虫基因组变异情况及地域株分子溯源问题，分别为日本血吸虫线粒体部分基因及全基因组(除AT区)DNA多态性研究、新型分子遗传标记在中国大陆、菲律宾日本血吸虫基因组变异中的应用、日本血吸虫地域性分子溯源标记开发及检测方法初步建立。　　本研究第一部分研究了中国大陆和菲律宾日本血吸虫线粒体蛋白结构基因、非结构基因及线粒体全基因组DNA的多态性。首先分别检测了中国大陆不同流行区日本血吸虫线粒体蛋白结构基因细胞色素b氧化酶(cytb)和非结构基因大、小亚基(16S、12S)的遗传多态性并重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系。分别以cytb、16S和12S基因作为研究对象对中国大陆11个流行地区日本血吸虫虫株进行扩增、测序。结果显示，日本血吸虫蛋白结构基因cytb部分序列变异率(1.67％)大于非结构基因16S和12S(0.92％和0.88％)，碱基突变类型均为转换大于颠换。无论是蛋白结构基因还是非结构基因均表现出东南湖沼区虫株间遗传差异大于西部山区型虫株。基于pcytb序列的种系发育分析显示，西部山区的四川和云南株聚在一起，东南湖沼区的湖北、浙江、安徽、湖南君山株聚在一起，湖南岳阳楼区虫株单成一支；而基于p16S和p12S序列的遗传关系图显示，即使同一来源地或流行区的虫株都没有聚到一起。表明线粒体蛋白结构基因较非结构基因涵盖更多的有效变异位点，能够显示种内遗传变异特点，更适合作为日本血吸虫分离株种系发育研究的遗传标记。　　继而扩增、测定了菲律宾和日本不同流行区日本血吸虫线粒体基因组全序列，并分析了菲律宾、日本和中国大陆虫株间线粒体全基因组序列差异。结果显示，菲律宾和日本虫株线粒体基因组序列全长不同，但各基因组成和排列方式均相同，除了coxl以GTG做为起始密码子外，其它基因的起始密码子均为ATG。菲律宾、日本和中国虫株比对分析结果表明，非编码区的变异最大，大部分蛋白编码基因的变异大于rRNA基因和tRNA；其中，非编码区存在一个菲律宾虫株特有的微卫星插入。各个基因的核苷酸变异主要发生在第三位密码子上。种系发育分析表明，不同种的日本血吸虫分别聚于不同的分支上，来自于同一个种不同流行地区的日本血吸虫分别位于各自的分支上。本研究对于揭示不同地域品系日本血吸虫线粒体基因组序列遗传多态性，研究日本血吸虫种群生物学以及开发分子溯源标记具有重要的意义。　　新型分子遗传学技术逐渐成为寄生虫群体遗传学及分类学研究的重要工具。本研究的第二部分利用反转录转座子间扩增多态性(IRAP)和反转录转座子微卫星扩增多态性(REMAP)两种新标记对中国大陆日本血吸虫的基因组变异进行了研究；利用相关序列扩增多态性(SRAP)标记对菲律宾日本血吸虫及其种上水平的基因组变异情况进行了研究。本章首先是利用IRAP标记研究我国大陆不同流行区日本血吸虫的基因组变异情况。通过对15条特异引物进行筛选，发现其中5条引物能够产生54条清晰且重复性高的DNA条带，其中多态性条带40条。引物LTR-11在500 bp和750 bp之间显示出一条雌虫特异的条带，可以用来区别日本血吸虫雌、雄虫。中国大陆所有虫株间多态性条带比值(PPB)为74.07％，西部山区型和东南湖沼型日本血吸虫显示出较为显著的差异性(PPB分别为48.15％和66.67％)。UPGMA分析显示，所有的虫株分为西部山区型和东南湖沼型两个分支，各个流行省的虫株分别聚在一起。表明IRAP标记可以有效地用于中国大陆日本血吸虫分离株的遗传多样性和种群结构研究。　　其次是利用REMAP标记研究我国大陆不同流行区日本血吸虫的基因组变异，以菲律宾和日本的日本血吸虫作为对照。本研究以15条LTR引物和10条锚定SSR引物随机组合成50个LTR-SSR引物组合。筛选获得8对能产生清晰条带且稳定性较好的引物组合。REMAP分析显示，中国、日本和菲律宾日本血吸虫三个种群间的PPB是77.37％。中国大陆虫株间PPB为66.32％，西部山区型和东南湖沼型各占18.42％和53.68％，两个流行类型间显示出较为显著的差异性，每个位点的有效等位基因数(Ae)分别为1.1537、1.3004。聚类分析显示，所有的虫株分为三个进化支--中国大陆、日本和菲律宾日本血吸虫。在中国日本血吸虫这个大的分支中，归属两个流行类型的虫株被分成两个分支，除湖南省外，其余7个流行省的分离株分别位于各自的小支；湖南岳阳楼区的虫株远离湖南长沙和君山的虫株单独聚成一个小支。揭示了REMAP标记在日本血吸虫种群遗传多态性研究中的有效性。　　最后利用SRAP标记研究菲律宾日本血吸虫及其种上水平基因组变异情况。通过对25个SRAP引物组合进行筛选，得到5对引物能够用于菲律宾日本血吸虫种群内及其种上水平的遗传多态性分析。菲律宾日本血吸虫所有虫株PPB为16.18％-25.74％，其中来自亚松森(Asuncion)的虫株最高；菲律宾种群PPB(47.79％)大于中国种群(41.91％)。菲律宾、中国和日本三个种群间的PPB是73.53％，表现出显著的差异性(Ae分别为1.2764、1.2863和1.1118)。以曼氏血吸虫作为外群重构种系发育关系显示，菲律宾、中国和日本的虫株分别位于不同的进化支上，显现出明显的地域特点。菲律宾日本血吸虫分成四个小的进化支，不同流行区域的虫株各自聚在一起；中国西部山区型和东南湖沼型日本血吸虫分成两个小支，显示出流行类型差异。种间分析表明，日本血吸虫总的PPB最高为24.26％，埃及血吸虫最低为1.47％。亚洲血吸虫(日本血吸虫和湄公血吸虫)和非洲血吸虫(曼氏血吸虫和埃及血吸虫)表现出显著的差异性(PPB分别为59.56％和43.38％)。以肝片吸虫作为外群重构种系发育关系显示日本、湄公、曼氏和埃及血吸虫分别位于不同的进化支上。但是，埃及血吸虫表现出与亚洲血吸虫(日本血吸虫和湄公血吸虫)更近的亲缘关系。本项研究结果为揭示菲律宾日本血吸虫及其种上水平基因组变异情况奠定了基础。　　本研究第三部分利用高分辨率溶解曲线(HRM)、特异PCR和酶切扩增序列多态性(CAPS)技术分别建立了日本血吸虫、中国大陆两种流行类型日本血吸虫以及中国云南省日本血吸虫的鉴别检测方法。本章首先建立了几种血吸虫的HRM检测方法。以核糖体18S基因作为遗传标记，根据日本、埃及、曼氏、湄公血吸虫在此区间上的基因差异设计引物，对这四种重要人兽共患吸虫进行了HRM分子分型鉴定。该方法表现出较好的特异性和较高的敏感性，为这四种重要人兽共患血吸虫的分子检测、鉴别诊断及流行病学调查奠定了基础。　　继而建立了中国大陆西部山区型和东南湖沼型日本血吸虫的特异PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法。通过对中国大陆不同流行地域日本血吸虫分离株线粒体全基因组序列进行比对分析，发现西部山区型日本血吸虫线粒体基因组序列比东南湖沼型虫株长2 bp，包含了一个2 bp的微卫星Indel。根据此差异设计引物，对来自中国大陆不同流行区日本血吸虫分离株进行了特异PCR分子鉴定，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率特点进行检测。结果显示所建立的方法能够有效区分中国大陆两种流行类型的日本血吸虫虫株，为我国日本血吸虫的流行动态监控，地域性分子溯源检测体系的建立奠定了基础。　　本章最后建立了我国云南省日本血吸虫虫株的CAPS检测方法。根据中国大陆不同流行省日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位3(cox3)基因序列差异分析，发现了一个可以区别云南省和其他流行省日本血吸虫的SNP位点。而此SNP位点恰好构成了酶切位点的改变，使得云南省日本血吸虫cox3序列不能被NdeⅠ限制性内切酶切开，而其他省份虫株因酶切位点完好可以被切开。利用这一差异建立了CAPS鉴别检测方法，对中国不同流行省日本血吸虫虫株进行分子检测。结果显示，该方法可以有效地将云南省日本血吸虫虫株与四川、湖南、湖北、安徽、江苏、江西、浙江其它省份日本血吸虫虫株区分开，将有助于监测日本血吸虫的分布变化情况，为血吸虫病溯源检测体系的建立及其防治工作开拓新的思路。　　综上所述，本研究分别利用日本血吸虫线粒体基因、RAP、REMAP、SRAP分子标记对我国大陆和菲律宾不同流行区日本血吸虫的基因组变异情况和种系发育关系进行了研究。并利用HRM、特异PCR和CAPS技术初步建立了日本血吸虫、中国大陆两种流行类型日本血吸虫虫株以及中国云南省日本血吸虫虫株的溯源检测方法。研究结果较为全面地反应了我国和菲律宾日本血吸虫的遗传多态性差异，探索了我国日本血吸虫的地域性溯源检测技术，不仅具有学术价值，而且为我国日本血吸虫病的有效防治和监控提供了参考资料。