胰岛移植在大鼠糖尿病肾病中的治疗作用及机制研究

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目的:  糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为目前糖尿病最常见的微血管并发症之一,严重影响了糖尿病患者的生存质量和预后。其以肾小球基底膜增厚,基质沉积及滤过屏障损伤导致的持续性高蛋白尿为主要特征,最终导致终末期肾功能衰竭。如何预防和治疗糖尿病肾病已成为当今糖尿病并发症的主要研究方向之一。近几年来,胰岛移植已经逐渐被认为是一种具有潜在治愈糖尿病及其相关并发症的重要治疗方法。而在糖尿病肾病的治疗中,胰岛移植也具备了常规胰岛素治疗所不具备的某些有利因素,在治疗、甚至逆转糖尿病肾病中发挥着重要作用。本研究中大鼠胰岛细胞团经分离纯化后进行肾被膜下移植,探讨胰岛移植对大鼠糖尿病肾病的改善甚至逆转作用,并评价其中相关信号通路的表达及作用机制。同时,对胰岛素与胰岛移植等不同处理方法在糖尿病肾病中的治疗效果进行评估和比较,为促进现有的临床胰岛移植的应用和发展提供一定的研究基础。  方法:  用于造模的大鼠禁食12h后,通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55mg/kg)诱导建立大鼠糖尿病模型。一周后通过尾静脉取血测定血糖浓度,当连续三日测定血糖浓度均大于16.67mmol/L时,可确认大鼠糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立成功后12周,取造模大鼠肾脏标本并通过透射电子显微镜观察大鼠肾小球内足细胞、基底膜及滤过屏障等微观结构损伤的变化情况,并分别测定尿微量白蛋白、随机尿蛋白等浓度与尿肌酐的比值,以衡量糖尿病大鼠肾脏损伤程度,并参照建模标准判断大鼠糖尿病肾病模型的建立是否成功。糖尿病肾病建立成功后,将 DN大鼠随机分成胰岛移植组(IT组)、胰岛素组(IN组)和阳性不处理组(DN组),每组分别进行不同治疗方法处理。同时,将8只正常大鼠作为阴性对照组(NC组)。各组大鼠的体重、血糖浓度及尿液相关指标每周测定3次并做好记录。处理4周后,各处理组大鼠颈椎脱臼处死,留取肾脏、血液等标本以待检测。通过 HE和 PAS染色观察各组小鼠肾脏内肾小球和肾小管等病理变化严重程度;通过免疫荧光和免疫组化检测胰岛素(Insulin)、足细胞蛋白(Synaptopodin)、TGF-β1、CTGF、MCP-1、HGF及α-SMA等指标的表达,并通过western blot对相关指标的表达进行定量检测。此外,运用透射电镜观察各组肾脏内部微观结构的变化及不同处理后的改善程度。  结果:  DN大鼠在胰岛移植后,血糖出现明显降低,并且直至实验结束均能持续稳定在正常水平(5.96±1.81 mmol/L);HE及PAS染色结果显示,移植大鼠肾脏系膜基质增生、肾小球毛细血管袢及局部基底膜增厚等病变均显著改善,而胰岛素处理组大鼠仍存在较明显肾小球糖原沉积、肾小球肥大及小球和小管细胞异常增生等病理变化。尿液指标检测结果也表明,胰岛移植后DN大鼠尿蛋白及尿微量白蛋白与尿肌酐比值明显下降,这表明胰岛移植能够显著改善和保护大鼠肾功能。此外,透射电镜观察结果显示,肾小球内基底膜增厚、足细胞损伤及足突融合等微观结构病变在胰岛移植后也得到了明显改善。免疫组化及 WB结果显示,糖尿病肾病大鼠在胰岛移植后,肾纤维化水平的改善也较明显。  结论:  结果表明胰岛移植对糖尿病肾病大鼠血糖调控、肾功能损伤及肾纤维化等均具有明显的改善和治疗作用,甚至在一定程度上逆转了糖尿病肾病的发展。而结果对比也显示,胰岛移植的治疗效果也显著优于单纯胰岛素治疗。移植后的胰岛在体内除了能够分泌胰岛素外,还能分泌胰高血糖素,胰岛素原及C肽等,对糖尿病肾病大鼠肾脏结构及功能损伤起着重要的改善和保护作用,这也在一定程度上为治愈或预防糖尿病病人发展成糖尿病肾病或者其他并发症提供了可能性。
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