积雪草在我国作为药用植物使用已有二千余年历史，为《中国药典》收载的常用中药材。本课题以积雪草的水溶性有效部位(积雪草总苷含量大于60％)为模型药物进行中药缓释制剂的处方设计及体外处方优化研究，进一步通过该药材体内物质基础创新测定方法的建立，对该积雪草总苷缓释片进行了比格犬的药动学考察，研究了积雪草总苷缓释片在体内的药动学变化、进行了生物等效性评价，研究结果为今后中药口服缓释制剂的处方设计、优化以及体内外评价方法提供了一定的理论依据和实践依据。本课题主要从以下几个方面开展实验： 一、可同时测定积雪草总苷缓释片中2个指标成分——积雪草苷和羟基积雪草苷RP-HPLC分析方法的建立本项研究以积雪草的水溶性有效部位(积雪草总苷含量大于60％，含量以积雪草苷和羟基积雪草苷之和计)为模型药物进行中药缓释制剂的处方设计研究。以反映主要药效的2个指标成分——积雪草苷(asiaticoside，AS)和羟基积雪草苷(madecassoside，MS)的释放控制为制剂研究主要目标，本实验首先建立了可同时测定积雪草苷和羟基积雪草苷的RP-HPLC方法。以DIAMONSILC18(250mm*4.6mm，5μm)为色谱柱，乙腈-甲醇-水(22：35：50)为流动相，柱温控制在25℃，流速0.8ml/min，检测波长为204nm，可同时用于释放液中AS和MS分离测定。方法学评价结果显示，积雪草总苷中MS和AS的峰面积与浓度之间呈良好的线性(浓度范围均为2～200μg/ml，r=0.9999)，方法的回收率MS为99.9～101.0％，AS为100.3～103.1％(n=6)，日内日间精密度小于1.9％。本方法可同时测定积雪草总苷缓释片释放液中的2个指标成分。方法专属性强，快速简单，重现性好。 二、积雪草总苷缓释片的处方设计和优化采用拟水平的均匀设计表U*66设计缓释制剂处方，RP-HPLC方法直接测定制剂中反映积雪草主要药效的2个指标成分——积雪草苷和羟基积雪草苷的释放度，利用指标成分的体外释放度及其特性参数与各辅料之间的回归方程(处方方程)对处方进行优化。实验得到的优化处方为：积雪草总苷为18mg/片，各辅料的组成为：羟丙基甲基纤维素(HPMC)30～75mg/片、微晶纤维素(MCC)50mg/片、7.5％聚维酮(PVP)醇溶液时，该处方可使指标成分在水中缓慢释放。 三、积雪草总苷缓释片体内分析方法的建立选择积雪草酸作为积雪草总苷缓释片的体内检测指标。积雪草苷在体内经二相代谢成积雪草酸起效，而积雪草酸在体内以大量结合物(约72％为葡醛酸结合物、18％为硫酸酯结合物)的形式存在，我们采用将含药血浆酸水解后测定积雪草酸总浓度的方法进行研究。首先以ED为催化剂、对甲苯胺为衍生化试剂，对生物样品中的微量积雪草酸进行柱前衍生化，初步获得了灵敏度较高可用于HPLC-UV检测的衍生化产物。采用HPLC-MS等方法初步确证了衍生化产物的结构。在此基础上，我们对血浆水解时间、衍生化反应条件进行了优化。实验进一步对内标、血样提取方法、色谱方法等条件进行筛选，最终选择熊果酸为内标，正己烷/CH2Cl2/异丙醇混合溶剂为提取溶剂，甲醇-水为流动相经梯度洗脱的柱前衍生化的RP-HPLC方法。 色谱条件如下： 色谱柱为DIKMAC18(250mm*4.6mm，5μm)；流动相为甲醇和水；梯度洗脱，程序设定如表1；流速：1.0ml/min；检测波长：248nm；进样量：50μl；柱温：25℃。Tab1TheprocedureofgradientoperationinHPLCTime(min)Ratioofmethanol/water085％885％3692％37100％43100％ 方法学考察结果表明，积雪草酸在0.01-1.5μg/ml浓度范围内具有良好的线性关系(Y=6.4361X+0.221，r=0.9996)，定量下限为0.01μg/ml(RSD=14.2％，n=5)；低、中、高三档浓度的方法回收率分别为105.1％、101.9％和101.6％，日内精密度分别为4.4％、5.8％、12.5％，日间(连续5天)精密度分别为4.6％、6.2％、14.2％。冻融试验表明，样品在30天内稳定。总之，所建立的HPLC方法专属性强，具有准确度好、灵敏度高、方便等特点，完全可满足积雪草总苷缓释片的体内药动学测定。 四、体内药动学以5只成年健康比格犬为受试对象进行双周期给药设计。5只比格犬首先口服参比制剂(普通制剂，含总苷540mg)，采血时间为0.5h，1.5h，2.5h，3.5h，4.5h，5.5h，6.5h，8h，10h，12h，18h，24h，36h。清洗期结束后，给服受试制剂(积雪草总苷缓释片，含总苷540mg)，采血时间同参比制剂。血浆样本进行按所确定的“积雪草总苷缓释片体内分析方法”进行分析和测定。 血药浓度-时间数据采用PKSV1.0软件进行药动学拟合统计，AIC法(Akaikesinformationcriterion)和F检验判别分别对药动学参数进行分析。 药动学结果表明，积雪草总苷缓释片的体内过程符合一室模型。主要药动学参数为：参比制剂t1/2=4.29h，tmax=2.7h，Cmax=0.74μg/ml，AUC0～t=3.74μg.h/ml，MRT=6.20h；受试制剂t1/2=10.29h，tmax=7.4h，Cmax=0.27μg/ml，AUC0～t=3.69μg.h/ml，MRT=16.81h。以上结果表明，受试制剂的tmax、t1/2、MRT明显延长，Cmax明显降低，表明缓释片具有良好的缓释效果，所研究的缓释片基本达到日服1次给药的目的。 五、生物等效性将Cmax、AUC0～t经对数转换后进行方差分析及双单侧t检验(α=0.05)，以AUC：80％～125％和Cmax：70％～143％为判定标准，考察两制剂是否具有生物等效性。相对生物利用度以AUC(缓释片)/AUC(参比)进行计算。 研究结果表明，受试制剂积雪草总苷缓释片的相对生物利用度为(99.30±9.60)％，受试制剂和参比制剂的AUC0～t无统计学显著性差异(P>0.05)，且受试制剂AUC0～t的90％置信区间为参比制剂相应参数的83.24％～121.8％，符合80～125％的范围，因此判断两种制剂吸收程度生物等效。 另外，经检验，受试制剂和参比制剂的Cmax具有统计学显著性差异(P<0.05)，受试制剂Cmax的90％置信区间已超出了参比制剂70％～143％的范围，结果表明两种制剂Cmax不符合生物等效性要求，受试制剂具有缓释特征。 Tmax的生物等效性采用非参数法(WilcoxonSignedRanksTest)进行检验，结果z=-2.04124，其中P=0.041227<0.05，说明两种制剂有显著性差异。 总之，以反映主要药效的指标成分的释放控制为目标的处方设计和优化技术，创新的体内积雪草物质基础的检测技术，我们以积雪草的水溶性有效部位为模型药物进行中药缓释设计的处方设计研究，比较了积雪草总菅缓释片与常释制剂在比格犬的药动学，评价了缓释片与常释制剂的生物等效性。结果表明：优化后的积雪草总苷缓释片其吸收程度与普通制剂生物等效，其tmax、t1/2、MRT显著延长，Cmax显著降低，显示积雪草总苷缓释片显著具有口服缓释的特征。 通过以积雪草总苷为模型药物的中药长效口服制剂处方设计研究，获得了可日服1次给药的积雪草总昔缓释片，这为今后中药口服缓释制剂的处方设计以及优化提供了一定的理论依据和实践依据。