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由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)引起的水稻瘤矮病分布于东南亚和东亚稻区,并局部流行,具有一定的经济重要性。本文利用酵母双杂交系统和双分子荧光互补技术进行水稻瘤矮病毒的蛋白自身互作及其与水稻蛋白互作的研究。首先构建了P2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母表达载体并进行自激活效应检测;以水稻瘤矮病毒总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得RGDV P2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的基因序列,分别连接到酵母表达载体pGAD T7和pGBK T7,构建阳性重组子pGAD-S2、pGAD-S3、pGAD-S7、pGAD-S8、pGAD-S9、pGAD-S11、pGAD-S12以及pGBK-S2、pGBK-S3、pGBK-S7、pGBK-S8、pGBK-S9、pGBK-S10、pGBK-S11、pGBK-S12。分别将阳性重组子转化酵母AH109,并涂布于不同的营养缺陷型选择培养基平板,检测RGDV P2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12蛋白是否具有自激活活性。结果表明,各重组阳性质粒均不具有自激活活性,而RGDV Pn10蛋白在酵母细胞中具有转录激活活性。其次,利用酵母双杂交系统进行RGDV P3蛋白自身互作的研究。将阳性重组子pGAD-S3和pGBK-S3共转化酵母AH109,并涂布于不同的营养缺陷型选择培养基平板,检测RGDV P3蛋白自身互作的情况。结果表明,RGDV P3蛋白自身存在互作。用双分子荧光互补技术在植物细胞内自然生理条件下对RGDV P3蛋白自身互作的情况做进一步验证。以阳性的酵母表达质粒pGAD-S3为模板扩增,获得S3基因,构建成重组双分子荧光互补表达载体pSPYCE-HA-S3和pSPYNE-Myc-S3。然后将带有HA标签的pSPYCE-HA-S3和带有c-Myc标签的pSPYNE-Myc-S3的重组双分子荧光表达载体分别转化农杆菌GV1301后,处理农杆菌后混合注射烟草。切取注射部位的烟草叶片组织于玻片上,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS STED, Germany)下观察烟草表皮细胞中黄色荧光表达情况并拍照保存。双分子荧光互补检测的结果与酵母双杂交的试验结果一致:RGDV P3蛋白自身存在互作。再者,利用酵母双杂交互补技术,以RGDV P2蛋白为诱饵筛选水稻cDNA文库。将诱饵质粒RGDV pGBK-S2和水稻cDNA文库质粒共转化到酵母AH109中,转化产物涂布于不同营养缺陷型选择培养基,从而筛选可能与诱饵蛋白P2互作的阳性克隆菌落。利用PCR鉴定阳性克隆中cDNA插入的片段大小,分别将含有不同大小插入片段的酵母质粒转化大肠杆菌DH5α,经序列测定和Blast比对,找到相关同源序列。根据同源序列相应的注释信息,分析所筛选到的阳性克隆中所插入的基因片段大小、基因序列完整性以及读码框正确性等。结果表明,以RGDV P2蛋白为诱饵筛选水稻cDNA文库最终获得了2种阳性克隆,即为水稻PC1、PC3蛋白。根据数据库中对应的同源基因的注释,并结合文献资料对互作蛋白的研究,初步推测蛋白互作在RGDV病毒侵染、致病和寄主应答过程中可能产生的作用。最后,为了进一步验证RGDV P2蛋白与水稻PC1、PC3蛋白之间的相互作用,提取水稻叶片总RNA后,通过RT-PCR扩增分别获得水稻PC1、PC3全长ORF基因序列,将其分别连接酵母表达载体pGADT7,构建阳性重组子pGAD-PC1和pGAD-PC3。将诱饵质粒pGBK-S2分别与重组子pGAD-PC1和pGAD-PC3共转化酵母AH109,转化产物涂布于不同营养缺陷型选择培养基,检测RGDV P2蛋白与水稻PC1、PC3蛋白之间的互作情况。结果表明,水稻PC1和PC3蛋白均能与RGDV P2蛋白发生互作。用双分子荧光互补技术在植物细胞内自然生理条件下对RGDV P2蛋白与水稻PC1、PC3蛋白之间的互作的情况做进一步验证。分别以阳性的酵母表达质粒pGBK-S2、pGAD-PC1和pGAD-PC3为模板扩增,获得S2、PC1和PC3基因,构建成重组双分子荧光表达载体pSPYCE-HA-P2、pSPYNE-Myc-PC1和pSPYNE-Myc-PC3。然后将三个重组双分子荧光表达载体分别转化农杆菌GV1301后,处理农杆菌后以pSPYCE-HA-P2+ pSPYNE-Myc-PC1和pSPYCE-HA-P2 +pSPYNE-Myc-PC3组合注射烟草。切取注射部位的烟草叶片组织于玻片上,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS STED, Germany)下观察烟草表皮细胞中黄色荧光表达情况并拍照保存。结果表明,水稻PC3蛋白能与RGDV P2蛋白发生互作,跟酵母双杂交试验结果一致;而水稻PC1蛋白不能与RGDV P2蛋白发生互作,跟酵母双杂交试验结果不一致。综上,本文构建了RGDV P2、P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母双杂交载体并进行自激活效应检测;通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术研究RGDV P3蛋白自身互作情况;利用酵母双杂交互补技术,以RGDV P2蛋白为诱饵筛选水稻cDNA文库,获得2种阳性克隆;并通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证RGDV P2蛋白与水稻PC1、PC3蛋白之间的相互作用关系。上述试验结果将可能为我们进一步了解RGDV的蛋白功能,RGDV的致病机理、寄主对RGDV的抗感病作用机制等研究提供依据。