细菌F5-2溶藻活性物质的分离与初步鉴定

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背景:目前为止已经开展了大量的研究来开发控制有害藻华的技术,这些技术可以概括为物理方法(例如粘土和絮凝剂),化学方法(硫酸铜,表面活性剂和次氯酸钠)和生物方法(植物竞争营养和食藻动物)。然而,这些方法或者成本高昂,或者操作不便,或者效果有限,有的甚至可能会导致潜在的灾难性的环境后果,而微生物控藻技术由于具有效果迅速明显,种属特异性高和环境友好等特征,是未来控藻技术的主要发展方向。目的与意义:1、在保持溶藻活性的前提下,探索有效脱除发酵液中总氮与总有机碳的方法,从而为发酵产物的下游处理与实际应用创造条件;2、获得纯的溶藻物质并初步解析其化学结构,为确定其化学结构创造条件,从而为进一步研究其溶藻机理、提高发酵效率及修饰合成更高效的杀藻剂奠定基础。方法与结果:本实验室前期分离到一株细菌F5-2,其菌液上清对赤潮藻异弯藻(Heterosigma akashiwo)有显著的溶藻活性,能观察到沉淀黄化死亡现象。其胞外产物对H.akashiwo有溶藻活性,为了探索溶藻活性物质的结构,首先进行了优化该菌发酵培养基中的碳源以提高溶藻活性物质产率,接着通过冷冻干燥、萃取及稳定性等试验对溶藻活性物质进行了粗提,再使用柱层析和HPLC技术进行精提和纯化,最后通过傅里叶红外光谱和液质联用技术对其结构进行了初步鉴定。结果表明:采用以1%的葡萄糖为碳源的MSI培养基较优化前培养基的成本下降了87%,溶藻效果提高超过5倍;冷冻干燥对活性物质的溶藻活性没有影响,对冻干产物可用乙醇进行有效粗提,且粗提物的溶藻活性受光照、溶氧和pH的影响较小;通过静态吸附及解吸实验确定了柱层析的固定相为200300目硅胶,流动相为乙醇;通过对比不同装柱方法,发现湿法装柱既可以有效精提溶藻物质且洗脱时间较短,经溶藻活性测试和TOC仪检测,精提样品在溶藻活性无明显损失的情况下,TN及TOC分别比发酵原液下降了98.45%和92.9%;HPLC的最优分离条件是:采用Inertsil Diol柱,检测波长为310nm,柱温为25℃,水和甲醇线性梯度洗脱:01min(85:15),110min(15:85),1015min(15:85),1516min(85:15),流速为1mL/min(分析型HPLC)或2mL/min(半制备HPLC),需要收集的溶藻活性物质为9.9min左右的馏分,采用半制备HPLC大量制备收集活性组分;经液质联用检测,确定溶藻活性物质分子量为271Da,经傅里叶红外光谱仪检测,发现该物质没有醛基,没有炔烃,有Ar-、-CH2-和C=N不饱和键,可能是胺类化合物。上述结果不但为进一步大量制备细菌F5-2的纯溶藻物质并采用NMR确定其结构奠定了基础,而且也为其它化感类溶藻物质的提纯提供了可供借鉴的操作流程。
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