前言Calpastatin(钙蛋白酶抑素)是钙激活蛋白水解酶calpain(钙蛋白酶)的内源性特异性阻滞剂,由N末端的非同源序列L区和120-140个氨基酸残基的4个重复序列1、2、3、4区(domain 1、2、3、4)构成的蛋白质。Domain 1-4承担calpain阻滞作用,然而,结构域L(domain L)却没有任何calpain阻滞作用,长期以来被称为是功能不明的结构域。我们最近的研究发现calpastatin还有钙通道活化作用,而且domain L单独也具有钙通道活化作用,说明calpastatin的钙通道活化作用可能是由domain L来承担的,并提出了calpastatin的双重作用假说：一方面活化钙离子通道使钙内流增加(domain L承担),另一方面又抑制钙激活的蛋白水解酶calpain (domain1-4承担)。然而,关于domain L的病理生理学作用及意义目前尚无任何研究报道。缺血／再灌注(isehemia reperfusion, I/R)损伤是指在缺血的基础上恢复血流后,组织器官的损伤反而加重的现象。随着休克治疗的进步以及溶栓疗法、动脉搭桥术、心肺脑复苏、心脏外科体外循环等方法的建立和推广,使许多组织器官缺血后重新得到血液再灌注,心肌等组织的缺血／再灌注损伤也成为基础和临床研究的热点。目前认为,其发生机制可能与缺血／再灌注期自由基生成过多、钙超载、微血管损伤和能量生成不足等有关,但其发生机制尚未完全阐明。此外,有研究认为缺血／再灌注损伤时高浓度的细胞内Ca2+很容易激活磷脂酶和钙敏感性蛋白如calpain。Calpain普遍存在于各种细胞中,有文献指出calpain的激活是心肌缺血再灌注的早期特征。研究也表明calpastatin可抑制calpain的活性,从而一定程度缓和了钙超载,保护细胞,提示calpastatin在缺血再灌注损伤的防治中可能发挥了一定的作用。因此,本课题采用离体大鼠心脏缺血／再灌注损伤模型,研究了calpastatin的domain L和domain 1-4的表达与缺血／再灌注损伤发生的相关性,旨在探讨capastatin特别是其domain L的病理生理学意义,并为防治心肌损伤提供新的可能途径。实验材料和方法1、试剂与仪器RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)。Trizol reagent(美国Gibco公司),calpastatin抗体(英国Saskatchewan大学惠赠),NP-40, PMSF,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,TEMED,过硫酸铵,甘氨酸,蔗糖,溴酚蓝,SDS,过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(中衫金桥),脱脂奶粉,Tween-20,预染蛋白Marker(均来自Biosharp公司)。PCR仪(杭州博日公司),HoferminVE凝胶成像仪(UVP,USA),垂直电泳仪(北京六一公司)等。2、模型建立：健康SD大鼠,体重250～300g,由中国医科大学动物部提供。1%戊巴比妥钠50mg/kg,及肝素500U／kg,腹腔注射。麻醉后,迅速沿前正中线剪开胸腔,暴露心脏,剪开心包膜,左手在心脏基底部和大血管连接处提起心脏,尽可能在离心端远处剪断主动脉,剪断心脏与其他血管的联系,取出心脏,放入用混合气体饱和的K-H液中,轻轻挤压心脏数次,排空心脏内血液,修剪血管连接处多余组织,保留适当主动脉长度,套入主动脉插管后用丝线结扎,悬挂在langendorff装置上,然后放入心脏恒温室,打开三通管,开始灌流。整个试验过程中温度控制在37℃、灌注压100cm H20,并于灌注过程中持续通入95%02、5%CO2的混合气体。模型分组(1)正常灌注组(对照组),离体大鼠心脏用K-H液灌注25min。(2)缺血组,离体大鼠心脏用K-H液灌注25min后停止灌注45min和灌注25min后停止灌注60min组(3)再灌注组,离体大鼠心脏用K-H液灌注25min后停止灌注45min复灌注15min组、30min组；离体大鼠心脏用K-H液灌注25min后停止灌注60min复灌注15min组、30min组。灌流后分别取大鼠左心室,冻存备用。3、RT-PCRTrizol法提取大鼠左心室的总RNA,按照TaKaRa RNA PCR(AMV)试剂盒进行反转录PCR,采用AMV (avian myeblastosia virus)反转录酶将mRNA合成cDNA的第一链,每次反转录实验按说明书操作步骤进行。用primer premier5软件设计引物,通过NCBI网站上的BLAST对引物的可靠性进行比对确认,之后由上海生工生物技术有限公司合成,序列见表1。表1,引物的核酸序列,退火温度及PCR产物长度4、Western blot提取大鼠左心室中的总蛋白,加入SDS样品缓冲液2.0μl,100℃煮沸5min,12%SDS-PAGE电泳分离蛋白质,然后将蛋白转至PVDF膜上,加入1：400倍稀释的calpastatin抗体,室温30℃孵育2h。取出孵育完毕的膜,TBST洗涤3次,每次5min。加入1：6000倍稀释的二抗,同上室温孵育2h。取出二抗孵育完毕的膜,在清洗好的膜上滴加ECL发光,成像分析。5、数据处理每组实验重复6次。实验结果应用SPSS 11.5统计学软件进行one-way ANOVA检验进行统计分析,所有数值用mean±SD表示,P<0.05被认为差异有显著性。实验结果1、半定量RT-PCR检测心肌缺血／再灌时calpastatin的domain L mRNA表达情况。心肌缺血45min及60min时,calpastatin的domain L mRNA水平与对照组相比显著降低(P<0.05)。再灌注15min后domain L mRNA水平有所恢复；再灌注30min时,domain L mRNA表达再次降低。2、半定量RT-PCR检测心肌缺血／再灌时calpastatin的domain 1-2、domain 3-4 mRNA的表达情况。心肌缺血45min及60min时,calpastatin的domain 1-2、domain 3-4 mRNA均与对照组比较,缺血45min组及60min组表达均明显下调(P<0.01,45min组；P<0.05,60min组)。再灌注15min后domain 1-2、domain 3-4 mRNA水平有所恢复。3、Western-blot法检测缺血／再灌时calpastatin蛋白表达。Calpstatin表达变化趋势和mRNA一致。以缺血45min表达下调最明显,再灌后有所恢复。结论1、心肌缺血时calpastatin的domain L mRNA表达水平下调；再灌注时表达有所恢复。2、心肌缺血时calpastatin的domain 1-2、domain 3-4 mRNA表达水平下调,再灌注时表达也有所恢复。3、心肌缺血／再灌时calpastatin蛋白水平,在缺血45min明显下调。本研究结果提示,在缺血／再灌注损伤中calpastatin的domain L和domain 1-4均扮演了重要的角色,calpastatin对缺血／再灌注损伤可能具有一定的保护作用。