论文部分内容阅读
CD151是四跨膜超家族蛋白(TM4SF)的癌基因,它可以促进细胞的运动、肿瘤的侵入和转移。CD151基因通过促进肿瘤组织血管生长及血运重建而发挥其促进肿瘤侵袭及转移的作用。CD151敲除以后,导致了整个血管形态结构的破坏。Wnt信号通路是肿瘤干细胞自我更新及致癌等功能中密切相关的重要信号通路。LRG1和LGR5都是Wnt信号通路的靶基因。LRG1蛋白能够促进肿瘤血管的生长,其在正常血管生长中较少发挥作用。LGR5通过促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达,从而促进血管生长,最终促进肿瘤形成与转移。肿瘤细胞在无血清培养基(SFM)中培养可初步富集富含肿瘤干细胞的肿瘤细胞球。肿瘤干细胞理论认为通过识别和利用肿瘤干细胞表面标志可以准确地筛选与分离肿瘤干细胞,CD133、CD44是目前被多数学者公认的结肠癌肿瘤干细胞标志物。目的:本研究通过Western blot方法对比研究结肠癌HT29细胞和敲除CD151基因(CD151-)的HT29细胞中Wnt通路相关靶基因LRG1和LGR5蛋白的表达与CD151的相关性,并通过流式细胞术高通量分选结肠癌干细胞技术筛选结肠癌HT29细胞和CD151-HT29细胞中高侵袭性CD44+CD133+HT29和CD151-CD44+CD133+HT29细胞亚群,检测其成瘤组织中LRG1和LGR5蛋白的表达差异及与CD151的相关性,旨在探讨CD151的表达对结肠癌侵袭与转移的作用。方法:1通过Western blot方法分别检测CD151+HT29细胞及CD151-HT29细胞的CD15、LGR5、LRG1蛋白的表达情况,以探究结肠癌细胞中CD151基因与LGR5、LRG1的关系。2通过流式细胞仪分别筛选无血清培养基(SFM)组CD151+HT29细胞、CD151-HT29细胞和有血清培养基(SSM)组CD151+HT29细胞、CD151-HT29细胞中CD44+CD133+的表达,以筛选肿瘤干细胞相关亚群。3采用细胞增殖实验、诱导分化实验对流式分选得到的CD133+CD44+结肠癌干细胞进行鉴定。4采用流式分选后继续培养的CD151+HT29细胞、CD151-HT29细胞、CD151+CD44+CD133+HT29细胞、CD151-CD44+CD133+HT29细胞分别种植于10只BALB/c-nu/nu裸鼠右侧腋窝皮下进行裸鼠成瘤实验,观察2周后成瘤情况。5通过Western blot方法分别检测CD151+HT29细胞、CD151-HT29细胞、CD151+CD44+CD133+HT29细胞、CD151-CD44+CD133+HT29细胞裸鼠成瘤组织中LGR5、LRG1蛋白的表达情况,以探究结肠癌种植瘤中CD151基因与LGR5、LRG1的关系。结果:1 Western blot结果显示:(1)CD151蛋白在HT29细胞中表达,在敲除CD151细胞中没有CD151蛋白的表达,提示该细胞株中不存在CD151基因的调控作用,(2)CD151-HT29细胞组和CD151+HT29细胞组相比,CD151-HT29细胞组LGR5和LRG1的蛋白表达下调,有统计学差异(P<0.05),表明人结肠癌HT29细胞中CD151基因缺失明显下调了LGR5和LRG1的蛋白表达。2流式细胞仪检测结果显示:CD151+HT29细胞SSM组和SFM组中CD44+CD133+细胞所占比例分别为:0.3%和1.4%,有统计学差异(P<0.05);CD151-HT29细胞SSM组和SFM组中CD44+CD133+细胞所占比例分别为:2.7%和7.3%,有统计学差异(P<0.05),表明无血清培养HT29细胞中CD44+CD133+所占的比例明显高于有血清培养HT29细胞。3细胞增殖实验结果显示:7天内CD151+HT29细胞随着天数的增加细胞数增多即OD值升高;CD44+CD133+CD151+HT29细胞球组中的细胞在前两天的生长较HT29组慢但是随后成直线的升高;CD44+CD133+CD151-HT29细胞球组中的细胞生长在前四天内较为缓慢在第五天后有所升高,CD151-HT29细胞组7天内的生长缓慢,CD151-HT29细胞以及分选后取第二次传代后CD151+CD44+CD133+HT29细胞球、CD151-CD44+CD133+HT29细胞球这三组细胞的以上生长趋势与CD151+HT29细胞组相比具有显著性差异(P<0.01)。表明分选后CD44+CD133+CD151+HT29细胞比分选前HT29细胞的增殖能力明显提高,敲除CD151基因后HT29细胞的增殖能力下降。诱导分化实验表明:将无血清培养液中形成的结肠癌干细胞球置于含血清培养液中培养可重新贴壁分化,细胞形态与之前培养的HT29细胞无明显差异,形成贴壁生长的单层肿瘤细胞。4裸鼠成瘤实验结果:2周后CD151+CD44+CD133+HT29细胞组、CD151-CD44+CD133+HT29细胞组、CD151+HT29细胞组和CD151-HT29细胞组裸鼠均成瘤,但CD151-CD44+CD133+HT29细胞组和CD151-HT29细胞组种植瘤均生长缓慢。裸鼠成瘤实验表明筛选后结肠癌细胞具有干细胞特性,同时表明CD151影响了种植瘤体的生长。5 Western blot方法分别检测CD151+HT29细胞、CD151-HT29细胞、CD151+CD44+CD133+HT29细胞、CD151-CD44+CD133+HT29细胞裸鼠成瘤组织中LGR5、LRG1蛋白的表达情况,结果显示CD151+CD44+CD133+HT29细胞成瘤组织中LGR5、LRG1蛋白表达明显高于其余3组,而CD151-HT29细胞组瘤组织中LGR5和LRG1的蛋白表达较其余3组明显下调,统计学比较有明显差异(P<0.05)。结论:1 CD151基因的缺失在HT29细胞中能明显下调LRG1、LGR5的蛋白表达。2无血清培养HT29细胞有利于肿瘤干细胞表面标志物CD44和CD133的富集;3通过流式细胞仪分选后HT29结肠癌干细胞的增殖能力明显提高,此类细胞能够促进结肠癌的侵袭和转移。4高侵袭的结肠癌干细胞中LRG1、LGR5的蛋白表达明显增强,提示CD151可能通过Wnt通路来介导增强结肠癌的侵袭和转移。