第一部分不同亚型NAD(P)H氧化酶所致氧化应激促进两肾两夹高血压大鼠心肌纤维化发展以及丹参酮Ⅱ A的抑制作用。 目的：高血压导致的心肌肥大在体循环高负荷长期存在时，会发生失代偿，出现充血性心力衰竭，增加死亡率。 方法：采用两肾两夹法(two-kidney two-clip，2K2C)建立肾血管性高血压大鼠模型。术后4周筛选出符合要求的高血压大鼠开始给药。实验共分5组，每组15只大鼠：(1)对照组(Sham)：假手术大鼠，每天灌胃给与等量的0.5﹪羧甲基纤维素钠；(2)模型组(2K2C)：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给与等量的0.5﹪羧甲基纤维素钠；(3)缬沙坦组(Val)：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给与60 mg/kg剂量的缬沙坦；(4)丹参酮Ⅱ A高剂量组(TanH)：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给与70 mg/kg的丹参酮ⅡA；(5)丹参酮ⅡA低剂量组(TanL)：2K2C手术的高血压大鼠，每天灌胃给与35 mg/kg的丹参酮ⅡA。每周测体重，按体重调整用药剂量，共给药6周。 结果： 1.2K2C手术后SD大鼠血压稳定增高，4周后达到180 mmHg以上，10周后血压稳定在187 mmHg左右；血流动力学参数左心室收缩压峰值(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室等容收缩期压力上升和下降最大速率(+dp/dtmax)和心率(HR)都明显升高；超声心动图参数收缩末期左室内径(LVDs)、收缩末期室间隔厚度(IVSs)、舒张末期室间隔厚度(IVSd)、收缩末期左室后壁厚度(PWs)、舒张末期左室后壁厚度(PWd)都明显增大，而舒张末期左室内径(LNDd)、射血分数(EF)、左室收缩分数(LVFS)明显减小；左心室重量与体重比值(LVW/BW)明显增大；Masson染色显示心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)都明显增大，羟脯氨酸试剂盒检测到心室肌胶原含量明显升高，这些指数说明2K2C大鼠10周后发展有高血压并伴有明显的心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍； 2.丙二醛(MDA)试剂盒显示2K2C高血压大鼠心肌中MDA浓度显著升高；共聚焦显微镜和化学发光法检测到2K2C大鼠的心室肌和主动脉中O<,2><'·->产生明显增多，说明存在明显的氧化应激； 3.化学发光法检测到2K2C大鼠的心室肌和主动脉中NAD(P)H氧化酶活性明显增强，心室肌主要利用NADH为底物，主动脉可以利用NADH和NADPH作为底物；Westen Blot和RT-PCR方法显示NAD(P)H氧化酶催化亚基p47phox的蛋白表达和转录都明显增高； 4.Nox不同亚型在2K2C大鼠的心室肌和主动脉中的表达变化不同，心室肌中Nox2和Nox4的蛋白表达和转录明显升高，而主动脉中Noxl和Nox4增高； 5.给与6周的缬沙坦和丹参酮ⅡA治疗后，发现缬沙坦有效降低血压和LVSP，而高低剂量的丹参酮ⅡA都对血压和INSP没有明显影响；但缬沙坦和高剂量的丹参酮Ⅱ A都能明显减小2K2C高血压大鼠的LNEDP、+dp/dtmax、LVDs、IVSs、IVSd、PWs、PWd，增大LNDd、EF、INFS，降低LVW/BW、CVF、PVCA和心室肌胶原含量，低剂量的丹参酮Ⅱ A也能改善部分参数，但效果略差于高剂量的，这些说明缬沙坦能降低高血压并减轻其伴有的心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍，丹参酮Ⅱ A显示不依赖降低高血压的减轻心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍的作用； 6.缬沙坦和丹参酮Ⅱ A都能明显降低2K2C高血压大鼠心肌中MDA浓度、减少心室肌和主动脉中O<,2><'·->产生、降低NAD(P)H氧化酶活性、减少催化亚基p47phox的蛋白表达和转录； 7.但对不同Nox亚基，缬沙坦和丹参酮ⅡA表现出不同的选择性抑制作用，缬沙坦降低心室肌和主动脉中的Nox1、Nox2、Nox4的蛋白表达和转录，而丹参酮Ⅱ A只降低Nox2、Nox4的蛋白表达和转录，对Noxl的变化没有明显的影响。高剂量的丹参酮Ⅱ A表现出比低剂量强的改善作用。 结论： 1．2K2C高血压大鼠发展有明显的心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍，心室肌和主动脉中NAD(P)H氧化酶活性增强导致的O<,2><'·->产生过多在上述病理发展过程中起重要作用； 2．心室肌和主动脉中NAD(P)H氧化酶的底物选择性不同，这可能和NAD(P)H氧化酶催化亚基Nox家族的不同亚型在心室肌和主动脉中的表达以及在病理条件下的变化的不同有关； 3．缬沙坦通过降低心室肌和主动脉中的Nox1、Nox2、Nox4的蛋白表达和转录、降低NAD(P)H氧化酶活性、减少O<,2><'·->产生等作用，产生降低高血压并减轻其伴有的心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍等效应； 4．丹参酮ⅡA通过降低Nox2、Nox4．的蛋白表达和转录、降低NAD(P)H氧化酶活性、减少O<,2><'·->产生等作用，产生延缓心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍等发展的效应，但对Nox1的变化和血压的升高没有明显的影响； 5．心肌肥大、纤维化和心脏收缩舒张功能障碍等发展和血压的升高可能与不同Nox亚基介导的NAD(P)H氧化酶激活有关。 第二部分过氧化氢通过增强NAD(P)H氧化酶所致的氧化应激促进心脏成纤维细胞胶原合成以及丹参酮Ⅱ A的抑制作用。 目的：血管NAD(P)H氧化酶激活产生的活性氧增多形成的氧化应激在心肌纤维化发展过程中起重要作用。 方法：应用<'3>H标记的脯氨酸和胸腺嘧啶掺入法测定H<,2>O<,2>对心脏成纤维细胞胶原合成和增殖的影响，以及丹参酮Ⅱ A的作用；用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测DHE氧化产物的荧光以测定O<,2><'·->产生；用化学发光法测定NAD(P)H氧化酶活性；应用Western Blot和PCR方法检测NAD(P)H氧化酶的催化亚基Nox家族的不同亚型Nox2、Nox4和调节亚基p47phox的蛋白表达和mRNA转录的变化。 结果： 1.1、10、100u M浓度的H<,2>O<,2>表现出浓度依赖性增加<'3>H标记的脯氨酸掺入量，表明促进胶原合成；而1和10 μ M浓度的H<,2>O<,2>对细胞增殖无明显影响，100 μ M浓度时表现抑制细胞增殖的作用；10 μ M浓度的NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI能明显抑制100 μ M浓度的H<,2>O<,2>的促胶原合成的作用，说明H<,2>O<,2>促进胶原合成的作用与NAD(P)H氧化酶的激活有关。100 μ M浓度的H<,2>O<,2>促进细胞外基质FN的合成分泌。 2.1、10、100 μ M浓度的H<,2>O<,2>浓度依赖性地增加O<,2><'·->产生，加入NADH和NADPH后比加入前O<,2><'·->产生增多，这说明利用NADH和NADPH两种底物的NAD(P)H氧化酶活性增强，并呈H<,2>O<,2>浓度依赖性。100 μ M浓度的H<,2>O<,2>刺激心脏成纤维细胞的NAD(P)H氧化酶活性增强，包括利用NADH和NADPH两种底物的酶，但酶更倾向于利用NADH为底物；100 μ M浓度的H<,2>O<,2>刺激NAD(P)H氧化酶催化亚基不同Nox亚型和调节亚基p47phox的蛋白表达呈时间依赖性增高，p47phox在3h达峰值， Nox2在1h达高峰， Nox4在3h达高峰，之后表达都持续增高。 3.丹参酮Ⅱ A剂量依赖性抑制100 μ M浓度的H<,2>O<,2>促进的心肌成纤维细胞胶原增殖；0.1和1 μ M浓度的丹参酮ⅡA对100μ M的H<,2>O<,2>的抑制增殖的作用表现改善作用，而10 μ M浓度的丹参酮ⅡA对细胞增殖表现更明显的抑制。1 μM浓度的丹参酮ⅡA和10μ M的DPI都能明显抑制H<,2>O<,2>的促进作用。 4.1 μ M浓度的丹参酮ⅡA明显减少100μ M浓度的H<,2>O<,2>刺激增加的O<,2><'·->的产生，也减少加入NADH和NADPH后H<,2>O<,2>刺激增加的O<,2><'·->的产生，降低幅度与DPI的作用程度相类似，这说明丹参酮Ⅱ A能抑制利用NADH和NADPH两种底物的NAD(P)H氧化酶活性的增强。1 μ M浓度的丹参酮ⅡA和10 μ M的DPI都能显著降低NAD(P)H氧化酶活性，DPI的抑制效果更明显些。1 μ M浓度的丹参酮ⅡA能显著抑制100 μ M浓度的H<,2>O<,2>在作用3小时后明显刺激的心脏成纤维细胞的p47phox、Nox2和Nox4的蛋白表达和mRNA转录。 结论： 1.H<,2>O<,2>通过刺激Nox2和Nox4依赖的NAD(P)H氧化酶的激活，增加的O<,2><'·->的产生，浓度依赖性地促进心脏成纤维细胞的胶原合成而不依赖于细胞增殖；H<,2>O<,2>对刺激p47phox、Nox2和Nox4表达增多的时间反应不同； 2.丹参酮ⅡA能通过抑制H<,2>O<,2>激活的Nox2和Nox4依赖的NAD(P)H氧化酶，减少O<,2><'·->的产生，浓度依赖性地抑制H<,2>O<,2>促进的心脏成纤维细胞的胶原合成而不依赖于细胞增殖。