烟粉虱和蚜虫都是世界性的害虫,它们主要通过直接取食或是间接传播病毒来危害植物并造成作物严重减产。目前所用的一些防治策略还是依赖于化学农药,但不当使用会造成环境污染、农药残留、诱导害虫抗性等问题。RNA干扰(RNAi)自发现以来已经被应用于多个领域,其中就包括害虫防治方面。研究者们通过针对害虫的基因(一般为一些看家基因或具有重要功能的基因),在植物中产生对应的dsRNA,害虫取食转基因植物后会诱导靶基因下调,并影响它们的发育甚至是致死,从而达到害虫防治的效果。传统的核转化植物抗虫效果不佳,主要是因为dsRNA不能稳定存在于细胞内,而叶绿体转化可以弥补这点不足。叶绿体是一种半自主性细胞器,其内没有RNAi机制,dsRNA在其中可以稳定存在,这弥补了核转化的不足,也为RNAi抗虫提供了一种新的策略。之前的一些研究显示烟粉虱和蚜虫对细胞核转基因植物介导的RNAi是敏感的,但是其抗虫效果不佳。可能原因是核转化dsRNA积累量不足或所选择靶基因不是最佳的致死基因。NDUFV2是线粒体复合体I的一个亚基,主要在呼吸链中催化NADH脱氢,且在不同昆虫中特异性高,是一个潜在的靶位点。本研究探索了通过叶绿体介导RNAi抗烟粉虱和蚜虫的可行性,试图寻找一种更加有效的刺吸式口器害虫的防治策略。主要的实验结果如下:以3周左右的烟草叶片为材料,利用基因枪转化的方法,将表达NDUFV2 dsRNA的表达盒整合到叶绿体基因组中。靶基因在相向启动子Prrn作用下起始转录产生dsRNA,经过筛选得到Nt-pXX3质体转化植株,通过Southern blot鉴定,结果显示各转化株系均到达同质化水平。Northern blot检测,结果显示靶基因对应的dsRNA在叶绿体中表达。通过核转化获得了8个独立的转基因株系,用qRT-PCR鉴定表达量后得到了2株Nt-pXX6(NDUFV2)相对表达量高的株系。生测实验表明相对于取食野生型烟草的烟粉虱,核转基因烟草和质体转基因烟草对烟粉虱均没有显著的致死作用。检测取食核转化烟草的烟粉虱的靶基因有下调趋势,第四天与取食野生型烟草的烟粉虱相比,取食核转基因烟草的烟粉虱靶基因下调水平为32%左右,但取食质体转化的烟粉虱的靶基因没有下调。进一步我们分析了两种转基因烟草对烟粉虱均不致死的原因。首先,通过PCR技术分析取食质体转化烟草烟粉虱体内是否含有叶绿体基因组。我们以烟草叶绿体基因组编码的psaB基因为检测对象,以取食人工饲料的烟粉虱为负对照,取食野生型烟草的烟粉虱DNA为模板PCR扩增psaB基因,结果显示未扩增到目的条带,表明烟粉虱是专一取食韧皮部筛管的刺吸式害虫。没有取食到叶绿体,部分解释了质体转化的植物没有抗虫效果的原因。在蚜虫中重复上述相同的实验,结果显示可以扩增到目的条带,蚜虫可能会取食到质体,进而通过体外点滴的方法筛选到了3个有效的致死基因(adar/dynei/v-ATPase),作为后期植物转化的靶标基因,奠定了质体转化抗蚜虫的基础。综上所述,该研究发现质体介导的RNAi抗烟粉虱策略是无效的,可能与其无法取食到质体有关;取食核转化植物烟粉虱靶基因有下调的趋势,但是要取得显著的抗虫效果,还需要筛选到一些更有效的靶基因。相对而言,蚜虫可以取食到质体,并且我们也筛选到了一些致死基因,为后期转基因植物介导RNAi打下了基础。本研究为转基因植物抗烟粉虱和蚜虫提供了一些借鉴意义。