丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)为单股正链RNA病毒,归于黄病毒科肝病毒属,主要经血液或血液制品传播。丙型肝炎是由HCV感染引起的慢性传染疾病,80%感染者转为慢性肝炎,且有相当比例的患者发展成肝硬化或肝癌。全球目前约有2.1亿人感染HCV,由于缺乏合适的动物模型及HCV基因组的频繁变异使得HCV疫苗研制面临挑战。干扰素——利巴韦林联合疗法是目前最有效的治疗方法,但仍有较大比例患者治疗无效并呈现明显的毒副反应。在HCV感染形势严峻的情况下,提高早期诊断效果成为治疗的关键,目前免疫诊断主要是检测抗-HCV,但该检测窗口期较长会延误治疗。而HCV Ag的检测能为临床诊断争取时间,因为HCV Ag的core蛋白一般在病毒感染2周左右即可产生,在体内抗体未转阳前通过检测core蛋白,能有效缩短窗口期。本研究通过原核表达获得稳定的HCV core蛋白,以此为免疫原制备筛选高纯度特异的单克隆抗体。首先获取阳性血清提取RNA,反转录扩增得到core1-120和core1-60基因,并构建表达载体pET28a-core1-120,pET28a-corel-60, pET41a-core1-60转化至大肠杆菌诱导表达,纯化后得到core1-120.core1-60和GST-core1-60蛋白。以core1-120蛋白免疫小鼠,常规单抗制备技术和间接ELISA法筛选单抗。注射单克隆细胞株至小鼠腹腔诱生腹水,经饱和硫酸铵沉淀和Protein A提取,最终获得7株针对core1-120蛋白的单克隆细胞株,分别命名为Wl至W7。单抗的亚型鉴定表明W1至W5、W7的亚型为IGg2b,W6为IgG2a；抗体亲和力测定表明W3至·W6株单抗的相对亲和力均达到1：640000；对细胞株连续6个月培养,除W6有稍许下降各细胞株所纯化的抗体保持相对稳定；纯化后的抗体经SDS-PAGE鉴定纯度达100%；根据抗体效价和亲和常数公式进行亲和常数计算,纯化后的7株单克隆抗体亲和常数均大于107L/mol,说明抗原抗体结合稳定；抗体叠加实验确定纯化的7株单克隆抗体表位,结果显示W1、W3、W4、W6和W7叠加率都<50%,即针对core1-120蛋白同一表位,W2和W5分别与其它单克隆株的叠加率>50%,针对不同表位,即7株单抗共针对core1-120蛋白的3个不同表位；抗体配对实验显示有12对配对,以W5标记W3和W7包被、以W3标记W5包被效果最好。确定的3对配对抗体,为后续HCV抗原抗体联检实验提供了有效的原材料,但由于缺乏HCV-cAg的阳性血样,对得到的3对单克隆抗体是否能够用于天然core蛋白配对和用于天然的HCV-cAg阳性血样的检测,还需要进一步的实验研究。