羧肽酶原B由胰腺细胞分泌，起初以含信号肽及前肽的前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)形式存在，在转运至内质网的过程中被信号肽酶切除掉信号肽而形成无活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B，proCPB)，羧肽酶原B在小肠经胰蛋白酶特异水解剪切前肽后而被活化成羧肽酶B。 羧肽酶B(carboxypeptidase B，CPB)是一类可水解蛋白或多肽底物C—端Lys或Arg的金属蛋白酶。羧肽酶B在科研上主要用于蛋白质、多肽的测序；在医学上用于诊断胰腺炎；另外，羧肽酶B是重组胰岛素的生产过程中不可缺少的一个工具酶。目前，商业途径获得的羧肽酶B主要从猪胰脏中提取，使得产品价格昂贵，同时也不可避免地混杂有其它蛋白酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。除了从胰腺组织中直接提取外，羧肽酶B也可通过基因工程途径获得。Hartman等和Li等分别研究了鼠CPB在大肠杆菌中的原核表达。Eaton等和Ventura等曾在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分别表达了人血浆羧肽酶原B和猪胰腺羧肽酶原B。王德解等利用巴斯德毕赤酵母pAOX1系统诱导表达了鼠羧肽酶原B，为探索利用GAP启动子(pGAP)取代AOX1启动子(pAOX1)的重组质粒在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中组成型表达鼠羧肽酶原B的可能性，本实验试图利用巴斯德毕赤酵母pGAP系统组成型表达鼠羧肽酶原B。 本实验中，根据GAP启动子目的基因的序列设计上下游引物，应用PCR技术以质粒pIB2为模板扩增了GAP启动子基因片段，在目的基因的两端分别引入SacⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，将GAP启动子基因片段取代诱导型质粒pPIC9K—proCPB上的AOX1启动子基因片段构建组成型表达质粒pGAPK—proCPB。用BglⅡ线性化pGAPK—proCPB重组质粒后，经电击转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布MD平板，筛选出阳性菌落，在含0.2％的葡萄糖培养基中培养工程菌，首次实现了鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的组成型表达，并在α—因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。表达产物经过疏水、离子交换层析纯化后，获得了重组proCPB目的蛋白。