背景和目的大金发藓（Polytrichum commune L.ex Hedw.）又名独根草、土马鬃等,属于金发藓科、金发藓属植物,全草入药,性寒、味甘,主治阴虚骨蒸、潮热盗汗、肺痨咳嗽、血热吐血等症。现代药理学研究证实大金发藓具有广谱抗肿瘤活性,可有效抑制包括白血病、乳腺癌、食管癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的生长,前期研究显示白血病细胞对该药物作用最为敏感。大金发藓乙酸乙酯组分（PC-EEF）是大金发藓主要的抗肿瘤活性成分,能显著抑制白血病细胞增殖,但其作用机制尚未完全明确,关于PC-EEF对耐药细胞株的研究也未见报道。本研究以人白血病细胞株K562及其阿霉素耐药株K562/DOX为研究模型,对PC-EEF诱导K562和K562/DOX细胞凋亡的机制进行了深入研究,并探讨PC-EEF与Doxorubicin （DOX）联合应用协同杀伤K562/DOX细胞的分子机制。方法和结果1. PC-EEF化学成分分析利用紫外分光光度法和高效液相色谱法对PC-EEF的化学成分进行定性定量分析,结果显示：①PC-EEF富含黄酮,其黄酮含量高达88.85±0.89%。②高效液相色谱图显示从PC-EEF中共分离得到9个主要的特征峰,其中两个特征峰的保留时间与标准品芦丁和木犀草素的保留时间相一致,提示PC-EEF中可能含有这两种黄酮单体的存在,其含量分别为4.76±0.04%和6.81±0.06%。2. PC-EEF诱导人白血病K562和K562/DOX细胞凋亡的机制研究以K562和K562/DOX细胞为研究模型,筛选出PC-EEF诱导肿瘤细胞发生死亡的药物剂量,通过形态学观察、生化分析和分子检测等鉴定细胞凋亡的典型特征,然后通过Ca²⁺螫合剂BAPTA-AM实验探究Ca²⁺与细胞凋亡之间的关系,最后对PC-EEF可能的作用机制进行分析。主要研究方法和结果如下：①MTT实验结果显示,PC-EEF以时间和剂量依赖的方式抑制K562和K562/DOX细胞增殖,IC50_24h分别为10.71 ± 0.09 μg/ml和16.98 ± 0.14 μg/ml,而芦丁+木犀草素对细胞的抑制作用不显著,提示PC-EEF中可能含有其他的抗癌活性组分。相同条件下,PC-EEF对人外周血单核细胞PBMCs的存活力无显著影响。此外,克隆形成和EdU插入实验进一步证实了PC-EEF对肿瘤细胞的增殖抑制作用。②超微结构观察证实肿瘤细胞膜在PC-EEF处理后发生了显著的形态学变化：流式细胞仪检测结果显示PC-EEF能够增强肿瘤细胞膜通透性,导致胞膜完整性破坏及膜电位去极化,其诱导作用呈现时间和剂量依赖性。由此推测,PC-EEF的细胞膜损伤效应可能与生长抑制和细胞死亡密切相关。③细胞内Ca²⁺水平在PC-EEF处理后4h显著升高,8h达到最高,并可持续到24 h仍维持在较高水平；加入Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM后,在降低胞内Ca²⁺水平的同时,几乎完全抑制了PC-EEF诱导的细胞存活率下降及膜完整性破坏,提示Ca²⁺稳态的紊乱在细胞膜损伤及细胞死亡过程中发挥主导作用。④免疫荧光、流式细胞仪分析和蛋白印迹实验显示,PC-EEF处理后,引起线粒体膜电位（MMP）下降、细胞色素C释放和Bcl-2/Bax比率下调；与此同时,凋亡相关蛋白Caspase 3的活性及其下游底物PARP的剪切显著增强；Annexin V/7-AAD荧光双染证实细胞凋亡比率显著上调,提示线粒体依赖性凋亡通路在PC-EEF抑制白血病细胞增殖方面起重要作用。⑤Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM存在时,MMP的下降和细胞凋亡比率的上升几乎完全被抑制,表明Ca²⁺与PC-EEF诱导的线粒体损伤及细胞凋亡密切相关。3. PC-EEF与DOX联合应用协同杀伤K562/DOX细胞的分子机制探讨以K562/DOX细胞为研究模型,实验主要对PC-EEF和DOX联合应用的可行性及优势进行了分析,并初步探讨了相关分子机制。主要研究方法和结果如下：①MTT实验证实,K562/DOX细胞对DOX具有很强的耐药性,其耐药系数RF_48h高达131,而对PC-EEF的耐药性相对较小,其RF_48h为1.91；PC-EEF和DOX的联合指数CI<1,具有协同作用,且9 μg/ml PC-EEF和DOX的协同性最好,其耐药逆转指数RI约为14.98,优于P-gp抑制剂LY335979的效果（RI=6.62）；选择最佳 PC-EEF剂量9 μg/ml,结合Viacount检测进一步证实了联合用药的优势。② Annexin V/7-AAD荧光双染实验显示,PC-EEF和DOX的联合应用相较于单独DOX处理（1,2μg/ml）,48h时细胞凋亡率分别上升了27.85±0.22%和57.60±0.47%。③荧光显微镜观察到PC-EEF可显著抑制P-gp底物Rhodamine的外排,并提高DOX的蓄积,其作用与1μM LY335979相当,且流式细胞仪检测结果显示此时细胞膜完整性尚未被破坏；免疫荧光结果证实联合用药可下调P-gp的表达量；Western blotting检测到联合用药后,p-PI3K、p-Akt的表达水平显著下调,提示PI3K/Akt信号通路的抑制可能与PC-EEF协同增敏DOX作用密切相关。④免疫荧光和流式细胞仪分析显示,联合用药可以协同增强胞内活性氧（ROS）产生、上调γ-H2A.X表达并加剧MMP下降；Western blotting检测进一步证实,DNA损伤修复相关蛋白γ-H2A.X和Cleaved-PARP的表达水平显著提高,而线粒体凋亡途径相关调控蛋白Bcl-2/Bax比率显著下降。⑤ROS抑制剂实验表明,NAC在清除过量ROS的同时,可以部分抑制联合用药诱导的细胞存活率下降、DNA损伤、线粒体损伤乃至细胞凋亡；此外,NAC预处理还可缓解联合用药对PI3K/Akt通路及下游靶蛋白P-gp的抑制作用,由此推测ROS在联合用药诱导K562/DOX细胞凋亡过程中扮演重要角色。结论PC-EEF通过损伤细胞膜系统扰乱胞内Ca²⁺稳态进而调控K562细胞发生线粒体依赖性凋亡；PC-EEF通过诱导氧化损伤及抑制PI3K/Akt通路协同增敏DOX对K562/DOX细胞的凋亡诱导效应。