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目的:血链球菌是人类口腔常驻菌群，属于条件致病菌，常见于牙菌斑，是引起感染性心内膜炎(infective endocarditis，IE)的罪魁祸首，其致病性与其在各种应激环境下的耐受情况密切相关。spx蛋白是一组全局性转录调控因子，在低GC含量的革兰氏阳性菌中高度保守，对细菌的应激耐受、生存、毒力和致病过程起到重要的作用。其中，spxA1与spxA2互为同系物，虽然二者结构高度相似，但却行驶着不同的生理学功能。spxA1参与细菌胞外多糖的产生，调节过氧化氢的释放;而spxA2在感受态的形成及细菌生存能力方面发挥一定作用。目前，spxA2在血链球菌致病中的具体调控机制尚不清楚。近年来，高通量测序技术以通量大、精度高、成本低廉等优势迅速得到普及，这为通过RNA-Seq技术研究转录组学奠定了基础。转录组学研究有助于了解特定生命过程中相关基因的整体表达情况，进而从转录水平初步揭示该生命过程的代谢网络及其调控机理。本实验借助高通量测序平台，通过转录组分析技术，揭示spxA2蛋白在分子水平对下游靶基因的全局调控，以期对其转录调控机制做出合理推测，为对血链球菌致病机制的深入研究奠定基础。 方法:1、用刚果红平板法检测细菌粘多糖(exopolysaccharides，EPS)的产生。将血链球菌SK36野生株、spxA1/spxA2突变株和互补株在刚果红平板上连续划线，分别厌氧培养16、24、36小时，观察菌落颜色变化。2、将血链球菌SK36野生株、spxA1/spxA2突变株和互补株分别接种于BHI液体培养基中，37℃厌氧培养16小时，1∶30稀释，40rpm振荡培养，用亚铁氰化铁平板法检测H2O2生成量。3、通过计算转化率评估细菌的自然感受能力。先用新鲜配制的TH1∶100稀释血链球菌SK36、spxA2突变株和spxA2互补株的过夜培养物，待其长至OD≈0.1，加入1μg染色体DNA，继续培养2～3小时，用无菌中性磷酸盐缓冲液(PBS)倍比稀释，分别涂到BHI平板和带卡那霉素的抗性平板上，观察菌落计数(Colony-Forming Units，CFU)并计算转化率。4、采用高通量测序技术对血链球菌野生株和spxA2突变株进行转录组分析，将测序所产生的数据mapping到SK36参考基因组上，获得各个基因的表达信息，应用基因组比对结果进行基因定量。利用edgeR软件分析△spxA2和WT中的基因差异表达情况。基于GOTermFinder软件，找出差异表达基因中显著富集GO条目，并推测差异表达基因行驶的主要生物学功能;利用Pathway分析进一步了解差异表达基因所参与的代谢通路及其具体的生物学意义。5、随机抽取若干差异表达基因，通过实时定量PCR对基因的差异表达情况进行验证。 结果:1、spxA1突变株在刚果红平板上生长到24小时，菌落颜色较血链球菌野生株开始明显变黑，36小时后突变株菌落颜色与野生株和互补株相比，显著变黑;而spxA2突变株与野生株和互补株比较，没有显著变化。2、spxA1突变株在亚铁氰化铁平板上较血链球菌野生株几乎不产生H2O2，而spxA2突变株不影响H2O2的产生。3、spxA2缺失突变株转化率仅为0.023±0.008×10-5，而野生株与互补株转化率无显著差异。4、通过对构建的6个文库进行测序，每个文库获得超过7000000条高质量的序列信息，约16.5Gb的数据量。de novo拼接后，获得1350条unigene，所得序列总长度约2.3Mb，平均长度为1675bp，N50长度为3542bp。测序深度趋于饱和，满足后续分析对于数据量的要求;测序序列实际覆盖度分布呈现均匀化，基因组上大部分基因已被覆盖。5、将序列数据与血链球菌SK36标准株基因组比对，比对上参考基因组的reads占总reads的比例在93.2％以上。通过与公共数据库COG、GO、KEGG、NR、NT和Swiss-Pro的BLAST比对，89.1％（1203个）unigene得到功能注释。其中，859个unigene注释到COG并被划分到25个功能类别，910个unigene注释到GO数据库，707个(52.4％) unigene被归为KEGG中的32条代谢途径。6、对△spxA2组和WT组进行基因表达差异分析，确定spxA2基因敲除株有17个基因表达量显著上升，5个基因表达量显著下降。对两组筛选到的差异基因进行GO功能显著性富集和Pathway显著性富集分析，结果表明，差异表达基因主要富集在氨基酸代谢生物学过程和酶活性细胞组分，共得到2条显著富集的代谢通路，涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及牛磺酸和牛磺酸代谢。7、实时荧光定量PCR分析，发现本研究spxA2基因敲除株SSA1398表达量显著低于野生株，SSA_2096、SSA_2351表达量均明显高于野生株，与转录组分析结果一致，但SSA_1615在野生株与突变株中的表达量没有显著性差异，与测序所得变化趋势不同，有待进一步验证。 结论:1、从细菌的表型上看，spxA2行驶的功能不同于spxA1。spxA2调控血链球菌感受态的形成，而不参与EPS和H2O2的产生（spxA1参与调控细菌EPS和H2O2，而不参与细菌感受态的形成）。2、RNA-Seq所得序列数据在测序深度、覆盖率及与血链球菌SK36标准株基因组的比对结果均理想，转录组测序结果基本能反映血链球菌的整个转录组情况。3、spxA2是一个全局性转录调控因子，参与了多个基因的转录调控，该蛋白的改变可导致血链球菌丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及牛磺酸和牛磺酸代谢通路发生变化，可为深入研究血链球菌致病机制及其与代谢途径之间的联系提供重要依据。