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研究背景足细胞(podocyte)和蛋白尿几乎涉及了所有肾小球疾病。足细胞作为肾小球固有细胞之一,附着于肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)的外侧,连同GBM和毛细血管内皮细胞一起,构成肾小球血液滤过的最后屏障。涉及此屏障的任何改变都可导致蛋白尿的发生。研究均证实蛋白尿的多寡以及持续时间均直接关系肾脏疾病的预后。作为血液滤过的最后屏障,足细胞已经成为针对蛋白尿研究的关键细胞[1]。足细胞脱落、凋亡以及随后足细胞数目减少是导致蛋白尿持续发生和疾病进展的重要原因,从某种意义上讲阐明了足细胞损伤的分子机制就有可能有效的阻止甚至逆转蛋白尿的发生。正常足细胞受损后可引起滤过屏障功能的改变,导致蛋白尿的发生。特别是在膜性肾病、微小病变型肾病及局灶性肾小球硬化(FSGS)已证明与足细胞的原发性及继发性损伤有关[2]。足细胞可被嘌呤核苷、各种抗体、补体及血流动力学等因素损害。病理状态下,足细胞在各种致损伤因素作用下可以发生非形态学的改变如足细胞特异蛋白分子(Nephrin, Podocin等)的下调和足细胞细胞骨架成分的变化等,也可发生形态学的改变如足突融合、细胞肥大、细胞凋亡等。许多因素如嘌呤霉素氨基核苷、TGFβ和AngⅡ等,都可以诱发足细胞的凋亡[3]。已证实在嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠模型和TGFβ转基因小鼠肾小球内都存在足细胞凋亡。Petermann等[4]把Heymann肾炎模型大鼠尿中的细胞用来培养,细胞仍可贴壁存活,且证实这些细胞主要是足细胞,说明活的足细胞可以从GBM脱落并从尿中排出;同时也提示除细胞凋亡外,足细胞脱落可能还存在其它原因,如GBM被MMPs或组织蛋白酶等降解破坏,或GBM被活性氧氧化损伤,或足细胞骨架蛋白发生重组,这些都可以削弱足突与GBM的粘附连接,导致细胞从GBM上剥离、脱落。足细胞作为一种终末分化细胞,足细胞在肾脏发育的S期退出增殖周期,呈现静止状态。在以足细胞损伤为主的肾小球疾病,如膜性肾病、微小病变病和原发性FSGS中,足细胞损伤缺失后不能再生,GBM裸露的区域只能依靠其周边细胞的代偿肥大去填补。当周边足细胞肥大失代偿或肾小球过度增生肥大,肥大的足细胞也不能完全覆盖GBM时,失去了足细胞支撑的GBM就会在毛细血管静水压的作用下,受压凸向肾小囊,进而与肾小球壁层上皮细胞粘连,造成细胞增生、损伤和细胞外基质成分的沉积,最终形成肾小球硬化[5]。足细胞在损伤过程中,足细胞为了适应环境变化,足细胞产生异常蛋白以保护足细胞,避免足细胞损伤加重。如病毒感染可以引起塌陷型FSGS,此类病变的足细胞具有细胞增生的表型。增生表型的出现常见于细胞高度去分化情况下,足细胞去分化包括细胞形态的改变及突起的丢失,细胞骨架成分的丢失尤其是肌动蛋白为主的骨架蛋白,尚有许多足细胞特异性蛋白如WTl,Synaptopodin, GLEPP1等表达缺失[6-7]。既往研究发现细胞核因子K B受体活化因子RANK(Receptor activator of NF-KB)及其配基RANKL(Receptor activator of NF-KB ligand)是近年来发现的一对细胞因子,为肿瘤坏死因子(TNF)及其受体超家族成员之一[8]。RANKL是破骨细胞分化、发育和成熟过程中起关键性作用的细胞因子。RANKL与其特异性受体RANK结合,可促进破骨细胞分化。骨保护素(0PG)可以调节这一旁路,通过与RANK的结合,将阻止RANKL与RANK结合进而抑制破骨细胞分化。OPG-RANKL-RANK信号传导途径如下:OPG是RANKL和TNF相关诱导凋亡配基(TRAIL)的诱骗(decoy)受体,可竞争性阻断RANKL与RANK结合,抑制RANKI发挥其相应作用。当RANKL和RANK的结合后,再募集TNF受体相关因子(TRAFs),后者通过特化的效应域激活核转录因子κB(NF-K B)或分裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)。MAPKs是一组包括多种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的家族,有ERK、P38、JNK等途径,并进一步参与调节细胞MMP活性。NF-κB为OPG/RANKL/RANK的信号传导的下游分子,能促进细胞因子的分泌,并调节细胞的生存、凋亡、分化及活化等[9-10]。既往对RANK-RANKL系统的研究主要集中在骨质疏松及骨肿瘤性疾病中。近年来,研究发现RANK-RANKL系统不仅参与淋巴细胞的发育及淋巴器官的形成,而且还可在胚胎肾脏、肌成纤维细胞、血管内皮细胞、乳腺上皮细胞、外周单个核细胞及胃癌等细胞中表达,该系统尚参与自身免疫性疾病的发生发展。在足细胞损伤的动物模型中,是否存在RANK-RANKL的异常,尚无文献报道。为了验证上述假说,本研究应用PAN诱导的动物模型、5/6肾切除动物模型及人类肾小球疾病中,观察RANK和RANKL表达,并体外培养足细胞,分析RANKL对足细胞凋亡的影响;通过RANK的siRNA技术转染条件永生性小鼠足细胞实现RANK基因沉默,观察RANK基因沉默后RANKL对足细胞凋亡的影响,初步探讨RANK和RANKL异常表达在足细胞损伤和肾小球硬化中的作用。研究目的1.在足细胞损伤的动物模型中,是否存在RANK-RANKL的异常表达?2. RANK-RANKL的异常高表达对足细胞的影响。研究方法一、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)对足细胞的影响(一)PAN动物模型的制作:36只性SD大鼠随机分为正常对照组(Con)、模型组(PAN),每组18只。嘌呤霉素氨基核营(PAN)溶入生理盐水配制成50mg/ml4度保存。PAN组单次尾静脉注射PAN100mg·kg-1,建立PAN足细胞损伤动物模型,Con组给予等量的生理盐水注射。于3、7及14天分三批处死动物,每次6只,分别检测不同时间点24小时尿蛋白、肾功能。(二)24小时尿蛋白及肾组织学的观察:大鼠于3、7和14天分三批处死动物,每次6只,分别检测不同时间点24小时尿蛋白、肾功能;HE和PAS染色及透射电镜观察肾组织学改变。(三) RANK、RANKL、Nephrin等表达的观察:分别用激光共聚焦(Confocal)、 Western blot和RT-PCR技术观察RANK、RANKL、Nephrin表达和分布。二、5/6肾切除动物模型中RANK-RANKL的表达(一)5/6肾切除动物模型的建立:中山医科大学实验动物中心提供的Sprague Dauley大鼠36只,体重150-200g,随机分为5/6肾切除模型组及假手术组各18只。大鼠第二次手术后,5/6肾切除模型组及假手术组。(二)24小时尿蛋白、生化指标及肾组织学的观察:各组大鼠分别于4、8、12周杀检,第4、8、12周各杀6只,分别检测不同时间点24小时尿蛋白、肾功能和电解质,光镜和透射电镜观察肾组织学改变。(三) RANK及RANKL表达的检测:RT-PCR检测RANK及RANKL mRNA的表达、免疫组化分别检测RANK及RANKL。(四) Western blot检测RANK及RANKL蛋白。三、人类肾小球疾病中RANK的表达(一)正常肾组织取白于肾癌手术切除标本。MN、IgA肾病、FSGS标本取自于本科肾活检标本,行肾脏病理检测。(二)肾脏病理免疫荧光检测RANK及Synaptopodin。四、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)对足细胞的影响(一)条件永生性足细胞的培养及诱导:条件永生性小鼠足细胞由Baylor医学院Danesh教授惠赠。首先在33℃20u/m1INF-γ1640培养基,Ⅰ型胶原包被的培养瓶,使细胞增殖,转入37℃无INF-γ的DMEM培养基中培养10-14d诱导分化,经鉴定表达Nephrin和Synaptopodin的细胞为分化成熟足细胞。(二)PAN诱导足细胞RANK表达。(三)RANKL对PAN诱导足细胞凋亡影响。(四)RANK基因沉默对足细胞的影响。(五)RANKL对足细胞钙离子浓度及足细胞K。。电流的影响。五、统计学方法:所有数据用均数±标准差(x±s)表示。根据不同的资料,使用相应的统计学方法,用PEMS3.1统计学软件进行统计,P<0.05有统计学意义。结果一、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)对足细胞的影响(一)PAN诱导的PAN大鼠逐渐出现大量蛋白尿、大量腹水和低蛋白血症呈典型肾病综合征的表现,并出现肾功能损害。病理呈现肾间质水肿、炎症细胞浸润、大量的蛋白管型及局灶节段性肾小球硬化及部分肾小管萎缩和纤维化。PAN组肾病大鼠精神状态差,出现大量腹水,并出现大量蛋白尿等典型的肾病综合征的表现。与对照组相比PAN组7天的动物24h尿蛋白显著增多[(135±29)mg vs(6.15±0.68),P<0.05],血肌酐水平显著增加[(49±5.87)u mol/Lvs(36.17±1.83)μmol/L,P<0.05]。(二)PNA注射3天,见肾小球及肾间质有大量的淋巴细胞浸润;PAN肾病大鼠7天时,出现足突广泛融合、容酶体坏死,肾间质水肿。免疫电镜结果显示:对照组RANK表达量少;PAN组RANK表达明显增加,主要分布在足细胞的足突胞膜和胞质内。(三)RANK及RANKL的表达和定位正常组大鼠RANK mRNA及蛋白低水平表达,PAN刺激后RANK表达显著升高。激光共聚焦显示RANK在PAN模型7天时表达最强,分布最广,而且与足细胞标志蛋白Synaptopodin高度融合,提示RANK的表达主要在足细胞上。正常组大鼠RANKL mRNA及蛋白处在较低水平,PAN刺激后也显著升高。二、5/6肾切除动物模型中RANK-RANKL的表达(一)尿蛋白、肾功能及肾脏病理变化与假手术组相比,大鼠5/6肾切除术后4周出现蛋白尿、血肌酐升高,随着肾衰时间的延长,24h尿蛋白含量和血肌酐浓度逐渐增高。5/6肾切除组,第4周肾小球增大不明显,有轻度的系膜细胞增殖和基质增宽。第12周系膜重度增生伴中、重度系膜硬化,普遍存在纤维素样渗出和球囊粘连。(二)肾脏RANK及RANKL高表达免疫组化、RT-PCR及Western-blot检测RANK及RANKL,结果显示RANK及RANKL在硬化组明显增加,而假手术组低表达。三、在人类肾小球疾病中RANK的表达(一)IgA肾病14例,膜性肾病16例,FSGS12例。FSGS患者的肾脏病理结果,PAS染色可以见到节段性肾小球硬化,膜性肾病的六胺银染色结果,可以见到钉突。(二)共聚焦显微镜显示:对照组RANK低水平表达,而在IgA肾病、MN及FSGS组肾脏中,RNAK表达明显增多,足细胞标志蛋白Synaptopodin与RANK高度重叠,在FSGS的硬化区域RANK低表达。四、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)对足细胞的影响(一)足细胞在33℃INF-γ的作用下呈鹅卵石样外表;转入37℃无INF-γ培养10-14天分化为星状有突起的足细胞,分化状态下的足细胞表达Synaptopodin及Nephrin。(二)PAN诱导RANK表达PAN刺激足细胞的表达RANK, RANK主要在胞浆及胞膜部位表达。(三)RANKL对PAN诱导的足细胞凋亡的效果RANKL对足细胞凋亡的浓度效应和时间效应。(四)RANK基因沉默对足细胞的影响RANK+/+足细胞F-actin成丝状,放射状排列,RANK基因沉默后F-actin的形态与RANK+/+足细胞无明显区别;PAN50μg/ml刺激后RANK+/+足细胞体积缩小’F-actin聚集、丝状结构不明显:与RANK+/+细胞比RANK-/-足细胞PAN50u g/ml刺激后F-actin收缩更为显著。RANKL预处理后,再用PAN刺激,RANK+/+足细胞骨架蛋白病变程度较轻,RANK-/足细胞经RANKL预处理后用PAN刺激12h骨架蛋白形态与没有预处理组比无明显改善。(五)RANKL对足细胞钙离子浓度及足细胞KCa电流等的影响我们的结果显示RNAKL降低足细胞内钙,但在PAN刺激下细胞内钙离子浓度显著升高。当细胞受到外界有害刺激时细胞内钙浓度瞬间急骤升高,导致细胞的损伤。RANL (40ng/ml)对KCa电流有明显抑制作用,电流密度从(9.03±1.42)pA/pF减少到(7.12±0.52)pA/pF(n=7,P<0.05),先给予thapsigargin(TG)处理后,再加RANKL,则可以消除RANKL对KCa电流的抑制作用,提示RANKL对Kca的作用为间接作用。PAN降低Ca2+-ATP酶,RANKL升高Ca2+-ATP酶,Tg则抑制Ca2+-ATP酶;RANKL升高Ca2+-ATP酶,并且与浓度有关,RANKL浓度越高,则Ca2+-ATP酶的活性越高。结论一、嘌呤霉素氨基核苷足细胞损伤动物模型中,RANK-RANKL高表达,RANK主要表达在足细胞。二、5/6肾切除动物模型中,肾脏组织高表达RANK-RANKL,并且高表达主要在足细胞上,提示RANK/RANKL在足细胞损伤中有重要价值。三、正常足细胞上RANK表达低水平,在IgA肾病、MN及FSGS人类肾小球疾病中,RNAK明显增加,足细胞标志蛋白Synaptopodin与RANK高度重叠,提示RNAK主要在足细胞表达,并且在FSGS的硬化区域RANK低表达。四、嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞产生RANK及RANKL,并诱导足细胞凋亡;RANKL抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞的凋亡,RANK及RANKL是足细胞损伤时的保护性反应,具有抗损伤功能。