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近几年来由于养殖方法不当和水体环境破坏导致各种鱼类病害频繁发生,给鱼类养殖业带来了很大的经济损失。维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)可以引起草鱼(Ctenopharyngodon idellus)败血症,短期内造成大量死亡,课题组前期从患病草鱼中筛选到了一株毒性较强的维氏气单胞菌AvX005。草鱼作为低等脊椎动物,当病源微生物入侵时,非特异性免疫发挥重要作用,而溶菌酶是非特异性免疫中的关键部分。本论文主要研究了草鱼g型溶菌酶和c型溶菌酶作为免疫刺激剂保护草鱼免受AvX005感染的作用机制,对草鱼健康养殖研究和应用具有一定的价值。为研究草鱼在感染AvX005后g型和c型溶菌酶的表达变化,采用qRT-PCR技术对感染AvX005的草鱼进行Lys-g和Lys-c的表达水平分析,结果表明草鱼感染AvX005后3 h肝脏和脾脏中基因lys-g和lys-c的转录均被显著诱导。在肝脏和脾脏中,基因lys-g的转录水平在感染后24 h达到峰值,分别提高13倍和4.5倍;基因lys-c的转录水平在感染后12 h达到峰值,分别提高7.5倍和27倍。因此推测两种溶菌酶蛋白在草鱼早期抵御AvX005感染的过程中有重要作用。在大肠杆菌重组表达系统中成功表达了目的蛋白rLys-g和rLys-c,经纯化后以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)为指示菌,检测发现重组蛋白具有溶菌酶活性,且对AvX005、嗜水气单胞菌(A.hydrophilia)AhX040、迟缓爱德华氏菌(Edwardisella tarda)均具有溶菌活性。通过转染使rLys-g和rLys-c在草鱼肝脏细胞L8824中表达,AvX005侵袭后发现与对照组存活率(46.3%)相比,rLys-g和rLys-c实验组细胞L8824的存活率(77.6%和68.6%)显著提高(P<0.05),结果表明重组蛋白rLys-g和rLys-c可以保护细胞抗AvX005感染。将pcDNA3.1-lys-g和pcDNA3.1-lys-c与佐剂QCDC混合后作为免疫刺激剂注射草鱼,经AvX005攻毒发现pcDNA3.1-lys-g和pcDNA3.1-lys-c可以为草鱼提供保护作用,其中未经预处理的草鱼全部死亡,而QCDC、QCDC+empty、QCDC+lys-g和QCDC+lys-c预处理后分别为草鱼提供了50%、60%、70%和70%的相对存活率。以上结果表明两种重组质粒pcDNA3.1-lys-g和pc DNA3.1-lys-c具有作为免疫刺激剂为草鱼感染AvX005提供保护的潜力。注射质粒能够诱导草鱼免疫反应,注射后血清中溶菌酶的活力短时间内分别显著(P<0.05)提高约1.7倍和2倍,碱性磷酸酶(AKP)活力分别显著提高(P<0.05)约3倍和2.4倍,酸性磷酸酶(ACP)活力没有显著变化(P>0.05),相关免疫因子C3、Ig M和IL8在草鱼肾脏中的表达量呈现不同程度地增加。综上所述,本研究表明草鱼感染AvX005后g型溶菌酶和c型溶菌酶的表达被显著诱导;溶菌酶的重组蛋白对AvX005有裂解活性,且能保护草鱼肝脏细胞L8824;pcDNA3.1-lys-g和pcDNA3.1-lys-c具有作为免疫刺激剂保护草鱼免受AvX005感染的潜力。