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[目的]
本研究拟利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),以血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)的Mrna为靶点,设计、构建VEGFR-2 shRNA的真核表达载体,特异沉默VEGFR-2的基因表达,阻断VEGF/VEGFR-2信号转导通路,探讨其对A549细胞增殖及凋亡的影响,从而为非小细胞肺癌(NSCLC)基因治疗寻找新的靶点。
[方法]
(1)在Genbank查找VEGFR-2 Cdna序列(NM002253),按照RNAi的设计原则,利用Ambion公司提供的设计软件,筛选出2个VEGFR-2的干扰靶点,同时设计一个阴性对照,并设计出相应的短发央结构的RNA模板。
(2)将互补配对的shRNA模板分别插入到pGenesil-1质粒中,构建3种重组质粒。DNA测序验证重组克隆的正确性。
(3)RT-PCR法分析重组质粒对VEGFR-2基因Mrna表达的抑制效应,Westernblot分析重组质粒对该基因蛋白质表达的抑制效果,同时筛选出沉默效果最好的表达质粒。
(4)将筛选出的沉默效果最好的质粒再次转染A549细胞,CCK-8法检测细胞增殖抑制情况,Hoechst染色检测细胞凋亡形态学变化。
[结果]
(1)测序结果显示:VEGFR-2 shRNA模板成功插入到pGenesil-1表达质粒中,成功构建shRNA重组表达质粒。
(2)RT-PCR及Western blot结果显示:与对照组相比,干扰组shRNA有效的降解VEGFR-2 Mrna,由于内源性VEGFR-2 Mrna减少,VEGFR-2蛋白也相应的减少。同时筛选pGenesil-1-VEGFR2-shRNA-1质粒组干扰效果更为有效。
(3)CCK-8法结果显示,在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,细胞增殖速度减慢,生长受到抑制,转染后72 h抑制率最高,与对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(P＜0.01)。
(4)Hoechst荧光染色显示,转染48 h后荧光显微镜下空质粒组的细胞细胞核呈弥散均匀荧光,且强度较弱,转染了干扰质粒的细胞可见典型的细胞凋亡形态,细胞核中可见致密的强荧光,荧光增强,胞核缩小碎裂,呈大小不等的不规则块状细胞碎片。
[结论]
VEGFR-2特异的shRNA能够有效抑制A549细胞中VEGFR-2基因的表达。VEGFR-2基因被沉默后,对A549细胞的增殖有明显抑制作用,并促进细胞凋亡。提示VEGF/VEGFR-2信号转导通路可作为非小细胞肺癌基因防治的理想靶点。