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目的(1)探讨IL-6和LPS对HaCaT细胞IL-15表达的影响及其相关信号通路;(2)构建IL-15基因系列启动子荧光素酶报告基因载体,分析IL-15基因启动子活性从而鉴定其关键调控元件。方法(1)培养HaCaT细胞,用IL-6和LPS分别处理,Real-time PCR分析IL-6和LPS对IL-15 mRNA水平表达的影响;Western-Blot分析IL-6和LPS对IL-15蛋白水平表达的影响。同时Western-Blot分析IL-6和LPS对HaCaT细胞信号通路MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT激活的改变,再使用其特异性抑制剂阻断IL-6和LPS激活的相关信号通路,检测IL-15的表达改变,从而探讨这些信号通路与HaCaT细胞IL-15表达之间的关系。(2)通过PCR方法从HaCaT细胞基因组中克隆七段逐步缺失的IL-15基因启动子序列;分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因载体pGL3-Basic质粒上,构建IL-15基因系列启动子荧光素酶报告基因载体;用脂质体转染法将其转染至HaCaT细胞,同时并转染海肾荧光素酶报告基因载体作为内参照,给予IL-6和LPS分别处理;刺激后采用双荧光素酶报告基因系统检测IL-15启动子活性,分析并鉴定IL-15启动子区关键调控元件。结果(1)IL-6和LPS均显著诱导HaCaT细胞中IL-15mRNA水平和蛋白水平的表达。信号通路分析发现IL-6和LPS均能显著激活信号蛋白ERK1/2、AKT的磷酸化,当用特异性抑制剂阻断ERK1/2、AKT磷酸化后,IL-6和LPS对IL-15表达的诱导作用也被明显抑制。(2)从HaCaT细胞基因组中经PCR方法克隆出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,重组到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic质粒后,PCR及双酶切鉴定证明各重组体构建成功;含IL-15基因最长启动子的重组体瞬时转染HaCaT细胞后IL-6和LPS分别刺激,然后经报告基因系统检测发现其具有明显启动子活性。结论(1)IL-6和LPS通过激活MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT信号通路诱导HaCaT细胞IL-15的表达。(2)成功构建IL-15基因系列启动子荧光素酶报告基因载体。