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研究背景缺血性脑血管疾病是临床神经内科的常见疾病,其治疗发展过程中的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)被认为是比疾病本身更具有破坏性,通常是决定预后的关键因素。脑神经元和神经胶质细胞的凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要病理表现,目前关于前者的研究较多,而后者的研究很少。星形胶质细胞在神经胶质细胞中体积最大,在哺乳动物脑内分布最广泛,同时它比脑内其他细胞具有更广泛的缝隙连接(Gap junctions, GJs)。缝隙连接是相邻细胞间细胞膜上传递信息的物质管道,由两个半通道(Hemichannel, HC)构成。缝隙连接蛋白是构成该通道的蛋白,其含量最多、分布最广泛的是连接蛋白43(Connexin43, Cx43),目前被证实跟各种颅脑损伤以及细胞凋亡信号传导密切相关。本实验使用缺血再灌注损伤体外模型(细胞氧葡萄糖剥夺-再恢复模型),通过对Cx43、半通道抗体1(HC1)和细胞凋亡标志物—半胱天冬蛋白酶3(Caspase3, Casp3)表达的检测,从细胞水平探讨星形胶质细胞Cx43及其半通道与细胞凋亡的关系以及在脑缺血再灌注损伤中二者可能起的作用。目的通过对细胞进行氧葡萄糖剥夺-再恢复(oxygen-glucose deprivation reoxygenation, OGDR)处理,研究Cx43及其半通道对星形胶质细胞活性的影响以及与星形胶质细胞凋亡的关系,探讨Cx43及其半通道可能在缺血再灌注损伤中的作用,从而为缺血性脑血管疾病的治疗和预后提供新的理论基础和治疗指南。方法人类大脑星形胶质细胞株通过细胞培养,使用免疫细胞化学染色检测胶质纤维酸性蛋白(星形胶质细胞标志物,glial fibrillary acidic protein,GFAP)、Cx43及HCl以鉴定其表达。细胞经常规培养、空质粒转染和特异性Cx43-shRNA转染后分为三组,分别为cell line组(正常细胞株)、Psup组(空质粒转染)和shRNA组(特异性Cx43-shRNA转染),通过免疫印迹法对每组Cx43和HC1的表达进行检测。每组细胞分别给予OGDR处理,各组内未处理细胞作为对照组。在不同的氧葡萄糖再恢复时间Ohour、4hours和24hours (Oh、4h、24h),用MTT法检测各组细胞活性,通过免疫印迹法检测各组Cx43,HCl和Casp3的表达。结果1.本实验使用的细胞可见Cx43+GFAP和HCl+GFAP的表达,鉴定结果为星形胶质细胞,且细胞膜存在Cx43及其半通道的表达。2. Cell line组和Psup组细胞中都有Cx43和HC1的表达,但在shRNA组中没有Cx43和HC1的表达,转染成功。3. OGDR后cell line组和Psup组星形胶质细胞的细胞活性在氧葡萄糖再恢复4h明显下降,与对照组差异有统计学意义(均P<0.05),而在氧葡萄糖恢复0h和24h的细胞活性与对照组差异均无统计学意义(均P>0.05)；shRNA组星形胶质细胞在氧葡萄糖再恢复0h、4h和24h的细胞活性与对照组差异均无统计学意义(均P>0.05)。4. OGDR后cell line组和Psup组星形胶质细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达在氧葡萄糖再恢复4h明显升高,与对照组差异有统计学意义(均P<0.05),而在氧葡萄糖恢复0h和24h的表达与对照组差异均无统计学意义(均P>0.05)；shRNA组星形胶质细胞中Cx43、HC1和Casp3在氧葡萄糖再恢复0h、4h和24h的表达与对照组差异均无统计学意义(均胗0.05)结论1.脑缺血再灌注损伤早期星形胶质细胞存活力降低,Cx43及其半通道可能起促进作用。2.脑缺血再灌注损伤早期星形胶质细胞凋亡增多,Cx43及其半通道可能促进了细胞凋亡进程,进而在预测早期脑缺血再灌注损伤方面起关键作用。3.虽然本研究中特异性Cx43-shRNA转染是作为一种分析工具,但临床中可能为改善缺血再灌注损伤后的脑细胞活性,减少细胞凋亡提供一个有前景的治疗手段。