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有机磷农药作为广谱、高效的杀虫剂，被广泛应用于各种农作物的生产，然而，部分高毒性的有机磷农药的大量使用会造成环境污染、作物药害及人畜中毒，其在农作物中的残留问题已引起了人们的普遍关注。目前检测有机磷农药残留的方法主要有仪器分析法、免疫分析方法及酶抑制法等。仪器分析法虽然检测精度高，但成本高通量低、前处理烦琐、不易广泛普及；免疫分析方法特异性好，但抗体制备周期长，成本仍旧较高，且具有多残留识别的宽谱特异性抗体的制备尚在研究阶段；酶抑制法快速、灵敏，尤其是其成本低，能广泛地应用于农作物中有机磷农药残留的现场、大批样品的检测。酶抑制法中乙酰胆碱酯酶是核心原材料，采用基因工程技术进行重组酶的制备是未来的发展方向。毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种真核表达系统，可分泌表达外源蛋白并对其进行翻译后修饰，通过发酵高效表达。另外，利用酵母表面展示技术可以使目的酶蛋白固定在细胞表面，直接用于酶制剂，同时，通过建立酵母展示系统可定向进化酶蛋白，提高生物活性。为此，本论文开展家蚕乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中分泌表达及表面展示方面的研究，主要研究内容及结果如下：
(1)分泌表达家蚕乙酰胆碱酯酶的毕赤酵母工程菌株的构建及鉴定
以四龄第三天家蚕头部为材料，采用Trizol法提取总RNA，进行逆转录反应，合成cDNA第一链。以此cDNA第一链为模板，设计引物ace(back)和ace(for)通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因(bmace)，其大小约为1900bp。以扩增出的bmace基因为模板，采用重叠延伸PCR的方法对序列中存在的两个A+T富含区进行同义密码子替换的改造，同时去除其N端的信号肽和C端的疏水肽。改造后的bmace基因片段与载体pPIC9K进行连接，转化感受态Escherichia coli DH5α，得到重组载体pPIC9K-bmace。重组载体经线性化后转化毕赤酵母GS115，通过PCR鉴定筛选出正确整合了bmace基因的重组子。
(2)家蚕乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析
以甲醇终浓度为1％的BMMY培养基对毕赤酵母重组子进行诱导表达，收集表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳分析和Western blotting检测，参照Ellman法测定rBmAChE的酶活，并以毒扁豆碱和有多种机磷农药的抑制性试验对其活性进行研究。结果显示重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70kDa的蛋白，诱导表达上清液中rBmAChE的酶活力约为39.3U/mL，比活为1187U/mg。rBmAChE的活性能被毒扁豆碱强烈抑制，IC50值为1.29×10-8mol/L，10种有机磷农药对rBmAChE的IC50分别为虫螨畏(2.43×10-6mol/L)、皮蝇磷(2.20×10-6mol/L)、氯唑磷(5.52×10-6mol/L)、嘧啶磷(5.83×10-6mol/L)、二嗪磷(6.03×10-6mol/L)、碘硫磷(6.57×10-6mol/L)、杀螟腈(7.01×10-6mol/L)、伐灭磷(7.35×10-6mol/L)、甲基对硫磷(8.47×10-6mol/L)、乙基对硫磷(8.15×10-6mol/L)，而氨基甲酸酯类农药克百威对rBmAChE的抑制中浓度为1.43×10-9mol/L，这表明rBmAChE具有较好的活性。
(3)毕赤酵母表面展示家蚕乙酰胆碱酯酶的初步研究
提取酿酒酵母INVSc1基因组DNA，以此为模板，扩增出编码α-凝集素的AGα1基因C末端960bp的片段作为锚定蛋白序列。设计引物，通过重叠延伸PCR的方法，用(Gly4Ser)3连接肽把前面改造过的bmace基因与锚定蛋白基因连接起来。融合基因bmace-AGα1与载体pPIC9K连接，构建成重组载体pPIC9K-bmace-AGα1，并转化毕赤酵母GS115，进行诱导表达。流式细胞仪检测结果显示经展示后的毕赤酵母重组菌中有20.62%带有荧光信号，展示后的BmAChE酶活达到102.4U/mL，按菌体重量计算则达到787.7U/g，毒扁豆碱对其抑制中浓度IC50为4.17×10-8mol/L，皮蝇磷、虫螨畏和氯唑磷三种有机磷农药对其抑制中浓度则分别为1.60×10-6mol/L、1.81×10-6mol/L和2.83×10-6mol/L。