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本研究以四川省眉山市青神县生慈竹和硬头黄竹幼笋为研究材料,采用Trizol一步法提取慈竹和硬头黄竹幼笋总RNA,进行RT—PCR得到相应的cDNA。以慈竹和硬头黄竹cDNA为模板,分别进行了慈竹4CL基因全长、慈竹4CL基因上游调控序列、慈竹β—tubulin基因保守区,以及硬头黄竹4CL基因保守区的克隆研究,并构建了慈竹4CL基因的中间表达载体。主要结果如下。
由慈竹得到1条新的4CL基因保守区片段。以这条保守区片段为模板,结合5’RACE和3RACE得到一条新的4CL基因全长序列。生物信息学分析结果表明,该序列CDS区全长为1674bp,编码558个氨基酸;氨基酸序列中存在SSGTTGMPKGV和GEICIRG两大4CL氨基酸保守域。该4CL基因全长序列提交Genbank注册,注册号为EU327341。同时,对这条慈竹4CL基因序列进行中间表达载体构建,将4CL基因和Part7载体一起构建成慈竹4CL基因中间表达载体。
以克隆得到的慈竹4CL基因全长序列为参照设计引物,以SDS法提取慈竹竹心基因组DNA,利用染色体步移技术(Chromosome Walking)扩增得到慈竹4CL基因的上游部分调控序列。该序列长420bp,具有植物启动子的基本元件TATA—box和GC—box,以及4CL—CMA2b等调控元件。
在慈竹中还克隆得到3条新的β—tubulin基因cDNA序列。生物信息学分析表明,这3条序列长度分别为958bp、958bp和959bp,分别编码318、318和319个氨基酸;氨基酸序列中包含有tubulin家族的标志性氨基酸保守域GGGTGSG。3条β—tubulin基因cDNA序列提交Genbank注册,注册号分别为EU246956、EU246957、EU246958。
硬头黄竹中,克隆得到3条新的4CL基因保守区片段,长度都为699,都编码232个氨基酸。经过NCBI网站Blast X程序和生物信息学分析证明为硬头黄竹4CL基因保守区序列。
本研究第一次在慈竹和硬头黄竹中成功克隆了木质素合成酶4CL基因和相关基因,为慈竹和硬头黄竹的改良奠定了基础。