目的:龋病是在以细菌为主的多种因素影响下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病,属常见病,多发病。位于牙根部的龋损称为根面龋,多见于老年人,是造成老年人牙颈部折断、牙齿丧失的重要原因。全国第三次口腔流行病学抽样调查结果显示:65岁至74岁年龄组的患龋率为98.4%,而治疗率仅达到9%-22%。我国面临着社会人口老龄化的问题,如何有效防治老年人龋病,尤其是根面龋已经成为一个社会性的问题。根面龋多发生在釉质牙骨质交界处的牙骨质,此处有机物含量高,矿化程度低,所以病变进展较快,且易向组织深部发展波及牙本质。北欧学者通过对健康根面和患龋根面菌斑成分进行研究,提出了“多细菌病因学说”(Polymicrobial etiology Hypothesis);而对致龋微生物生物学特性的研究结果显示:变形链球菌是最重要的致龋菌,对根面龋的发生起重要作用。在防治根面龋方面,某些传统药物存在着一些不足,例如:硝酸银的使用,虽然可以有效地抑制龋病的进展,但由于该药具有强腐蚀性,会对口腔软组织造成损害,且引起牙体组织变色,造成其使用受限。因此,开发疗效确切、使用安全的药物具有重要意义。茶多酚(tea polyphenols TP)是近年来研究较多的一种天然抑龋药物,它是茶叶(特别是绿茶)中所含的一类多羟基酚类化合物的总称,约占茶叶干重的20%～30%;其主要成分为儿茶素(catechins),约占茶多酚总量的80%左右。茶多酚既是一种天然的抑菌剂,同时又是一种高效低毒的自由基清除剂和抗氧化剂,应用于口腔疾病的治疗,可以抗龋病,消除口臭,促进口腔黏膜溃疡愈合,抑制口腔黏膜癌变等等。本文将就茶多酚对人工根面龋的抑制作用进行探讨,为茶多酚应用于临床防治根面龋提供实验依据。方法:1预备离体牙:选择60颗60岁以上老人因牙周炎Ⅲ°松动拔除的磨牙(根面完整,无裂痕,无龋坏),刮除牙周膜、牙石,超声清洗5min,干燥。选取牙根近中面(或远中面)作为试验区,在釉牙骨质界下1mm的牙体组织上制成6mm×6mm见方的牙骨质块,去离子水超声清洗12min,吹干试验区并在中部预留5mm×5mm的开窗区,其余部位涂指甲油保护。将预备好的牙骨质块随机分为4组,每组15个标本,置75%乙醇溶液中消毒,4℃冰箱保存备用。2制备菌悬液:将变形链球菌国际标准菌株(S mutans. Ingbritt C)厌氧条件下〔(φ(N2)=85%,φ(CO2)=10%,φ(H2)=5%〕复苏48h后,接种于BHI固体培养基中,厌氧条件(以下厌氧环境均同上)、37℃恒温培养24h后,挑选单个菌落,传代培养三次,经生化鉴定确定为变形链球菌后将细菌转种于BHI液体培养基中,厌氧环境、37℃恒温培养24小时,使用紫外分光光度计测量并用无菌生理盐水将菌液OD值调整为1.0。3制备茶多酚溶液:将上述茶多酚粉末按2倍稀释法溶于BHI液体培养基使其最终浓度分别为64mg/ml, 32mg/ml, 16mg/ml, 8mg/ml, 4mg/ml, 2mg/ml, 1mg/ml, 0.5mg/ml。4最低抑菌浓度测定:采用纸片琼脂扩散法,测量抑菌环直径,每个浓度做8个标本。5建立人工根面龋模型:将各牙标本置于菌悬液中,37℃恒温、厌氧培养48h后,取菌液进行钙离子浓度测定。测定方法:用原子吸收光谱法(条件:日立Z2000原子吸收分光光度计,Ca2+空心阴极灯,灯电流7.5mA,光谱带宽2.6nm,空气1.60kg/cm2,乙炔0.26kg/cm2),将样品摇匀后直接上机测定。6药物处理早期人工龋:将脱钙后的离体牙重新置入新鲜菌液,并每隔48h更换一次菌液。在此期间分别用蘸有最低抑菌浓度的茶多酚溶液、380mg/ml氟化氨银溶液、20mg/ml氟化钠溶液和去离子水的饱和小棉球涂擦标本表面开窗区(5min/次,3/日)。各取第48h,96h,144h菌液做钙离子浓度测定(方法同5);最后每组取2个标本做扫描电镜观察。7扫描电子显微镜观察:取出的牙骨质块经0.1%PBS液漂洗三次后立即放入2.5%戊二醛内预固定24h,1%锇酸后固定2h。再次用0.1%PBS缓冲液漂洗三次,75%-85%-95%-100%-100%乙醇梯度脱水,临界点干燥,喷金。在扫描电镜下观察开窗区表面结构的变化。8数据分析:数据用x±s表示,采用SPSS13.0统计软件包进行单因素方差分析,两两比较采用t检验。结果:1茶多酚的最低抑菌浓度:茶多酚溶液在浓度大于等于4mg/ml时,有抑菌环出现。将各浓度抑菌环直径数值进行单因素方差分析得P<0.05,进行两两比较后得出:茶多酚溶液浓度在4mg/ml-32mg/ml范围之间,随着溶液浓度的增大,抑菌环直径呈增大的趋势(P<0.05);但是在浓度为32mg/ml和64mg/ml时,其抑菌环的直径无明显差别(P>0.05)。体外抑菌试验结果:茶多酚的最低抑菌浓度为4mg/ml。2钙离子溶出量的测定结果早期人工根面龋模型制备后,测量A、B、C、D 4组菌液中的钙离子含量,经统计学比较,这四组数值之间无明显差别(P>0.05),因此可以认为四个组的早期人工根面龋处在同一水平。药物作用于人工根面龋48h、96h、144h时,经方差分析,四组菌液中钙离子含量存在明显差别(P<0.05),进行两两比较后得出三个药物处理组之间钙离子的含量均存在明显差别(P<0.05),380mg/ml氟化氨银抑菌作用最强,4mg/ml茶多酚的抑菌作用介于380mg/ml氟化氨银和20mg/ml氟化钠之间。且随着作用时间的延长,茶多酚组的菌液中钙离子含量呈减少的趋势,显示良好的时间-效应关系。3扫描电镜观察空白对照组中,可以见到牙体硬组织脱矿后形成的典型的蜂窝状结构,存在着大小不等的孔隙和陷窝,有些空隙内可见碎屑。在牙体表面的某些区域,可以见到粘附于牙面的细菌菌落。380mg/ml氟化氨银组:牙体组织表面结构破坏轻微,可见牙体硬组织脱矿后所形成的陷窝,数量较少。4mg/ml茶多酚组:被破坏的牙骨质板表面有大小不等的孔隙,仍可辨出牙骨质的板层状结构,高倍镜下见陷窝、腔隙,数量较少;基质纤维的断裂,碎屑附着于牙体表面。20mg/ml氟化钠组:牙体组织表面结构破坏较明显,并可见到发生钙化的细菌菌落。结论:1茶多酚溶液在浓度为4mg/ml时即可抑制变形链球菌的生长。2茶多酚溶液可以抑制牙骨质的脱钙。3微观结构观察显示:茶多酚组的牙骨质表面结构与空白对照组比较存在差异。4茶多酚有较好的抑制根面龋的作用