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研究背景宫颈癌(cervical cancer,CC)是一种发生于宫颈上皮最常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率仅次于乳腺癌。目前宫颈癌的发病逐渐趋于年轻化,对女性生命健康造成了极大危害。宫颈癌的发生和发展与持续感染高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)密切相关,但宫颈癌的发病原因及发病机制目前尚未完全阐明,深入探索宫颈癌发生发展的具体分子机制,获取有效的宫颈癌诊疗途径,是目前宫颈癌临床防治的研究方向。肿瘤微环境作为肿瘤细胞所处的外环境,其与肿瘤细胞相互作用,在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。肿瘤微环境中血管生成作为肿瘤发生发展以及转移的基础,是恶性肿瘤发生发展中的关键事件之一。血管内皮细胞作为微环境的重要细胞组成成分,是肿瘤血管形成过程中的有效靶点,其功能的改变是肿瘤血管生成的基础环节。外泌体是细胞通过胞吐作用分泌至细胞外环境中的具有功能活性并可通过多种途径介导细胞间物质与信息传递的囊泡小体。释放到细胞外环境中的外泌体可通过靶细胞膜的胞吞作用或是膜融合的方式与靶细胞进行相互作用,是一种新型的细胞间通讯途径。越来越多研究表明肿瘤细胞分泌外泌体在肿瘤血管形成方面具有重要作用。外泌体装载大量蛋白质、脂质、核酸等多种有效生物活性成分,外泌体中富含的小分子核酸成分是外泌体介导的细胞间交流的重要生物活性成分。研究内容:1.人子宫颈鳞癌细胞分泌外泌体的鉴定和生物活性评估1.1 Siha-Exo 和 Ect1-Exo 提取及鉴定制备去外泌体胎牛血清(FBS),配制含10%去外泌体FBS DMEM细胞培养基培养Siha细胞和Ect1细胞,收集两者细胞培养上清;通过一系列差速离心法分别提取Siha-Exo和Ect1-Exo,超速离心完后,超速离心管上可见白色米粒大小的附壁沉淀;透射电子显微镜下观察Siha-Exo和Ect1-Exo形态,可见外泌体典型形态:磷脂双分子层的典型杯口状囊泡样结构;Western blot结果显示Siha-Exo和Ect1-Exo均表达外泌体蛋白阳性标志物CD63、CD81;1.2 Siha-Exo和Ect1-Exo生物活性评估将相同浓度Siha-Exo、Ect1-Exo分别与人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养,激光共聚焦显微镜观察HUVECs摄取Siha-Exo和Ect1-Exo情况,观察可见绿色荧光标记Siha-Exo和Ect1-Exo均被HUVECs吸收至细胞浆内,点状散在附着于红色荧光细胞骨架上,分布于蓝色荧光的细胞核周围。证实Siha-Exo和Ect1-Exo均具有生物学活性。2.人子宫颈鳞癌细胞分泌外泌体促血管生成效应的功能验证2.1 HUVECs体外增殖、迁移和成管实验检测Siha-Exo和Ect1-Exo血管生成效应将相同浓度的Siha-Exo和Ect1-Exo分别与HUVEC共培养48h,设置PBS空白对照组,行体外增殖(CCK8)、体外迁移(Transwell)和体外成管实验,结果显示Siha-Exo组中HUVEC体外增殖能力、迁移能力和成管能力明显高于Ect1-Exo组以及PBS组,Ect1-Exo组和PBS组间无明显差异。2.2 HUVECs体内基质胶栓实验模型检测Siha-Exo和Ect1-Exo血管生成效应将相同浓度Siha-Exo、Ect1-Exo与HUVEC共注射至裸鼠腹股沟部位,设置PBS空白对照组,7d后取出胶质栓包埋、切片后行HE染色,显微镜下观察统计结果提示Siha-Exo组基质胶内成管数量明显多于Ect1-Exo组和PBS组,Ect1-Exo组和PBS组间无明显差异。3.人子宫颈鳞癌细胞分泌外泌体RNA的提取和成分分析3.1 Siha-Exo RNA和Ect1-Exo RNA的提取和质控分析miRNeasy 试剂盒(Qiagen)提取 Siha-Exo、Ect1-Exo、Siha 细胞和Ect1细胞中RNA,通过Agilent2100检测仪行质控分析,结果示Siha-Exo和Ect1-Exo内RNA成分与各自来源细胞的中RNA成分相比较具有显著差异,Siha-Exo RNA、Ect1-Exo RNA中均富含小RNA(sRNAs)。3.2 Siha-Exo非编码RNA和Ect1-Exo非编码RNA的成分注释Siha-Exo RNA和Ect1-Exo RNA高通量测序结果提示Siha-Exo和Ect1-Exo的非编码RNA中microRNAs占较大比例。