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卵母细胞减数分裂成熟是动物生殖的核心环节，受多种因子的调节。内皮素-1是卵巢局部的重要调节因子，在卵泡发育、排卵、黄体的形成和退化、激素合成与分泌中发挥着重要作用，但其具体作用机制至今仍不清楚。本课题主要研究内皮素-1(ET-1)对小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟活化的调节作用及其可能的信号通路，有助于我们进一步了解卵母细胞的发育、成熟机理及其调控，为开辟新的促生育和抗生育途径提供新的实验依据。
方法1. 实验动物模型制备及复合卵与裸卵的获取与培养 取体重15-18g(约3-4周)的雌性昆明小鼠，用外源性促性腺激素孕马血清(PMSG)诱导小鼠超排卵，46～48 h后断头处死小鼠，取出双侧卵巢置于预先在37℃、5％CO<,2>、95％空气、100％湿度培养箱平衡过夜的操作液中(M199培养液)。在体视显微镜下，剔除卵巢周围的脂肪及结缔组织，用5号针头穿刺有腔卵泡，释放出卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-OOCytecomplex，COC)。选择外围紧紧包着3～5层卵丘细胞且均匀一致的COC。裸卵(denuded OOCyte，D0)是用口吸管反复机械吹打COC获得。将COC和D0分别移入每孔装有490μ1培养液，并加入不同处理因素的4孔培养板内，每孔15～20个卵母细胞。然后每孔覆盖石蜡油150μl，在37℃、5％CO<,2>、95％空气、100％湿度培养箱内培养。于不同时间点在体外培养条件下观察ET-1等不同处理因素对D0和COC体外成熟的作用，以GVBD作为细胞核成熟的标志，PBl作为胞质成熟的标志；
2.利用RT-PCR技术检测COC中c-erbB<,2>mRNA和c-mybmRNA的表达总RNA提取：300个COC→加入O.5ml裂解液一冰上裂解，静置5分钟→加入0.1ml氯仿，剧烈摇晃15s充分混匀后→4℃离心10000g×20分钟→将上层液相移入另一以DEPC水处理的1.5mLEP管中→加等体积异丙醇丙醇，混匀，置冰上约20分钟，4℃离心10000g×20分钟，沉淀RNA→弃上清→加75％乙醇1ml，充分洗涤RNA沉淀→用0.1％的DEPC水15μl重悬沉淀→进行RT—PCR检测。
逆转录：取1.0μg总RNA，加DEPC处理的水至10μ1，70℃水浴5分钟，迅速冰上冷却→加入随机引物、dNTPs、Rnase抑制剂、MgCl<,2>、逆转录酶和无菌双蒸水至20μ1，37℃水浴1h，90℃水浴5min，反应完后，迅速冰上冷却。
PCR扩增：取逆转录产物cDNA 5μl，反应缓冲液5μl，dNTP混合液，TaqDNA聚合酶，c-erbB<,2>mBNA或c-myb mRNA上、下游引物，β-actin上、下游引物，加无菌双蒸水至50μ1→在PCR扩增仪中进行扩增→PCR扩增产物在2.0％琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外透射分析仪观察后照相→凝胶图象分析系统对PCR扩增产物进行半定量，以扩增条带的光密度与β→actin扩增带的光密度的比值代表细胞中mRNA的表达水平。
3.利用western blot技术检测COC中ERKl、ERL<,2>磷酸化水平和cyclinB<,1>蛋白的表达300个COC／1.5mlEP→加入RIPA裂解液40μ1，及蛋白酶抑制剂，4℃裂解1小时，每5分钟混匀一次→取1μ1进行蛋白定量→其余样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)→电转移→免疫定位→化学发光→显影定影→凝胶图象分析系统分析结果
结 果
1.ET-1呈剂量依赖方式抑制COC的体外成熟，但对D0的体外成熟无明显影响：
2.P可促进COC的体外成熟，并能反转ET-1对COC体外成熟的抑制；
3．COC中有原癌基因c-erbB<,2> mRNA和c-myv mRNA的表达，并且在卵母细胞GVBD后表达增强，ET-1可减弱c-erbB<,2>mRNA和c-myb mRNA的表达，P可部分反转ET-1对c-erbB<,2>mRNA和c-myb mRNA表达的抑制作用；
4．COC中有ERK<,1>、ERK<,2>和 cyclinB<,1>蛋白表达，ET-1可减弱ERK和cyclinB<,1>蛋白的活性，P可部分反转ET-1对ERK<,1>、ERK<,2>和cyclinB<,1>蛋白活性的抑制作用。
结论
1．ET-1为卵巢局部调节物质，能抑制COC的体外成熟，P可以反转ET-1对小鼠COC体外成熟的抑制作用；
2．COC中有c-erbB<,2>mRNA、c-myb mRNA、ERK<,1>、ERK<,2>和cyclinB<,1>蛋白的表达，c-erbB<,2> mRNA、c-myb mRNA的表达，ERK<,1>、ERK<,2>和 cyclinB<,1>蛋白的活性与COC的体外成熟能力密切相关；
3．ET-1调控COC体外成熟的机理可能与下调卵母细胞原癌基因c-erbB<,2>和c-myb的表达，ERK<,1>、ERK<,2>磷酸化水平和cyclinB<,1>的含量有关。