1.目的　　黄独素B(DB)是黄药子中一个主要的二萜内酯类化合物，具有良好的抗肿瘤活性，但又具有较强的肝毒性。课题组前期研究表明，黄DB在2-16 mg/kg剂量下，对S180荷瘤小鼠具有显著的抗肿瘤作用，ED50为2.5 mg/kg。另外文献报道DB在10 mg/kg的剂量下，对S180荷瘤的抑瘤率为57.9％。然而在体外的人胃癌细胞系SGC-7901、黑色素瘤细胞系A375、人口腔表皮样癌细胞株KB及小鼠淋巴白血病细胞株L1210试验中，DB均未显示出明显的抗肿瘤作用。那么DB在体内是否存在代谢活化现象？其抗肿瘤的作用机制是否与代谢活化有关？　　黄药子的肝毒性与其DB的含量密切相关。本课题组的前期研究表明，DB对小鼠的急性毒性剂量为150 mg/kg，慢性毒性剂量为32 mg/kg。并且证明了黄药子对小鼠的肝毒性存在显著的性别差异，对雄性小鼠的毒性高于雌性。那么，DB的肝毒性机制是否与代谢有关？　　本课题的研究目的是从研究DB的代谢出发，鉴定其代谢产物、阐明其代谢途径、鉴定代谢酶，对其是否存在代谢活化现象作出明确的解释，初步判断代谢对于DB的抗肿瘤作用和肝毒性的影响;研究DB在大鼠体内的吸收、分布和排泄，从侧面阐述代谢对于其药理作用的影响;采用3T3细胞考察DB代谢前后的细胞毒作用，采用大鼠原代肝细胞考察DB代谢对肝毒性的影响，进一步阐明代谢对其抗肿瘤活性和肝毒性的影响。　　2.方法　　(1)体外代谢:采用大鼠、小鼠、豚鼠、兔和人肝微粒体与DB孵育，UPLC-MS方法检测代谢产物;添加捕获试剂如甲氧铵盐、GSH捕获反应性代谢产物，结合文献鉴定代谢产物的结构。　　(2)体内代谢:大鼠灌胃给药DB(32mg/kg，75mg/kg)后，于不同时间点取血，血浆样品经处理后，检测代谢产物;大鼠灌胃给药DB(32mg/kg，75mg/kg，150mg/kg)后，收集尿液和粪便，经处理，检测其中的代谢产物;大鼠麻醉后，胆管插管，收集空白胆汁，然后将DB注射入胃(75mg/kg)，分别收集给药后2h，4h，8h的胆汁，胆汁经处理后，检测其中的代谢产物。　　(3)代谢产物制备:采用化学合成的方法制备DB与谷胱甘肽(GSH)的加合物。制备过氧丙酮(DMDO)催化DB生成DB的双醛衍生物，再加入GSH与该衍生物反应，生成DB与GSH的加合物。采用半制备液相的方法制备产物，冻干后采用NMR的方法鉴定结构。　　(4)大鼠体内药动学:建立大鼠血浆中DB含量测定的UPLC-MS/MS方法;采用灌胃(32mg/kg)和尾静脉注射(0.5mg/kg)给药的方法，研究DB在大鼠体内的药动学行为，获得其绝对生物利用度。　　(5)排泄研究:建立大鼠尿液和粪便中DB的含量测定方法;收集大鼠灌胃给药DB后，24～48小时，尿液和粪便的排泄量，计算排泄分数，从侧面了解DB在大鼠体内的代谢量。　　(6)代谢酶鉴定及酶促动力学:以制备获得的GSH与DB的加合物M31为指标，采用重组人工单酶、化学抑制剂试验鉴定代谢酶;对人肝微粒及各代谢酶进行酶促动力学研究，结合相关活性因子的方法，对各代谢酶的贡献进行预测。　　(7)代谢活化对细胞毒性的影响:采用3T3细胞模型，评价DB代谢前后对细胞的毒性，采用大鼠原代肝细胞模型，考察DB及酮康唑抑制CYP3A4活性后DB对肝细胞毒性。　　3.结果　　(1)体外代谢:在Tris-HCl的体外肝微粒体孵化体系中发现了11个代谢产物(M1-M11)，磷酸盐缓冲液体系中发现2个代谢产物(M12-M13)，其中M1-M3为DB在CYP450酶催化下，形成顺式2-丁烯-1，4二醛衍生物后，再与Tris碱形成的加合物，该衍生物为反应性代谢产物;M4-M6为M1-M3的氮脱烷基产物;M7-M9为DB的反应性代谢产物与Tris碱加合后再脱水形成的产物;M10-M11为DB的单羟基化产物，M12-M13为DB的反应性代谢产物迸一步被氧化形成的半缩醛内酯。代谢产物结构的鉴定表明，DB的代谢过程中存在反应性代谢产物。种属差异主要体现在，豚鼠和兔相对大鼠、小鼠、人的肝微粒体孵化体系中多出一个单羟基化产物。　　在以甲氧铵盐为捕获试剂的孵化体系中，发现了13个相关产物，结合文献鉴定了结构，进一步证实了反应性代谢产物的存在。　　在以GSH为捕获试剂的孵化体系中，发现了9个DB与GSH的加合物，主要的代谢产物为单个GSH与黄独素B加合后，再经分子内反应生成的产物(M27～M31)，其中含量最高的为M31。　　(2)体内代谢:大鼠灌胃给药DB(32mg/kg，75mg/kg)后，血浆中未检出代谢产物;32mg/kg，75mg/kg剂量下尿液中发现了单羟基化产物，150mg/kg剂量下未发现;32mg/kg剂量下，粪便中发现了反应性代谢产物形成的半缩醛内酯M12、M13;150mg/kg剂量下发现了黄独素B与GSH的加合物;胆汁中发现了黄独素B与GSH的加合物。黄独素B的体内外代谢较为一致。主要的代谢途径是经CYP450酶催化形成顺式2-丁烯-1，4二醛衍生物的反应性代谢产物，再进一步与亲核试剂，如GSH加合;另一途径是形成单氧化产物。　　(3)代谢产物制备:获得了GSH与DB的加合物(M31)，经NMR鉴定，M31由3位巯基取代和2位巯基取代的吡咯衍生物组成，两者的比例为1.2∶1;同时获得了半缩醛内酯产物(M12、M13)，即DB的呋喃环转变成了半缩醛内酯环。M12的结构中，半缩醛与13位（季碳）相连，内酯的羰基与14位(CH)碳相连，M13的结构中，半缩醛与14位(CH)碳相连，内酯的羰基与13位（季碳）相连。M12与M13的比例为5∶1。由于半缩醛羟基的差向异构化，使得M12，M13均为一对对映体组成。　　(4)大鼠体内药动学:DB灌胃后，入血较快，雌雄大鼠的Tmax分别为0.67±0.39h，0.48±0.39h。药动学行为呈现明显的性别差异，灌胃给药后，雌性和雄性大鼠的Cmax，AUC(0-t)存在显著性差异，雌性的吸收显著高于雄性。静脉注射给药后，雌雄大鼠在所有的药动学参数上均存在显著性差异，DB在雌性大鼠体内分布更广，半衰期更长。雌雄大鼠的口服绝对生物利用度分别是2.0％，0.3％。　　(5)排泄研究:大鼠灌胃给药DB24h后，大部分以原形经粪便排泄，雌性排泄约84％，雄性约67％;很少部分经尿液排泄，24h时雌雄大鼠的尿液排泄分数分别为1.14％，0.68％，48h时雌雄大鼠的尿液排泄分数分别为1.83％，1.03％。提示DB在雄性大鼠体内代谢相对较多。　　(6)代谢酶鉴定及酶促动力学:采用重组单酶进行体外孵育试验，以M31的产量为指标，发现DB代谢活化的主要酶为CYP3A4、3A5、2C9、2C19，其中3A4的能力最强。化学抑制剂试验表明，3A4被抑制后，M31的产率与对照组（无抑制剂）相比下降87％，2C9、2C19被抑制后，分别下降15％和27％。　　酶促动力学研究表明，3A4与2C19的Vmax相当，均为6.3 pmol·min-1·pmol-1 CYP;3A5，2C9的Vmax相当，分别为2.0，1.9 pmol·min-1·pmol-1 CYP，约为3A4与2C19的Vmax的1/3;3A4对DB有中等的亲和力，Km为68.3μM，3A5和2C19的亲和力相当，分别为98.5，92.0μM;2C9的Km最大为133.8μM，亲和力最低。采用相关活性因子的方法预测在DB的浓度为5和40μM时，各代谢酶对其代谢的贡献率，3A4为83.3，81.3％;2C9为10.5，12.2％;2C19为6.2，6.6％。　　(7)代谢活化对细胞毒性的影响:DB在0.1-200μM浓度下，对3T3细胞无直接毒性，在50-960μM浓度下，经小鼠肝微粒体代谢后，对3T3细胞也没有毒性。DB在5-200μM浓度下，对大鼠原代干细胞具有明显的毒性（5μM时p＜0.05;10-200μM时p＜0.01），且在5-50μM范围内，随浓度增加，毒性增加。　　酮康唑对DB的肝毒性的具有明显的保护作用，随DB浓度的增加逐步显现出来，在DB的高浓度下（50-200μM），保护作用显著。CYP3A4的活性被酮康唑抑制后，DB的代谢减少，反应性代谢产物的生成减少，由此而产生的肝毒性降低了。　　由以上实验结果推测DB的抗肿瘤活性是在肿瘤细胞内代谢产生的，需要采用CYP450酶，尤其是CYP3A4高表达的肿瘤细胞来评价DB的抗肿瘤活性。　　4、结论　　(1)DB存在代谢活化的现象，其主要代谢途径是经代谢形成反应性代谢产物顺式2-丁烯-1，4二醛衍生物，该反应性代谢产物再进一步与体内外的亲核试剂，如Tris碱、甲氧铵盐、GSH等结合，形成加合物。　　(2)DB代谢活化的酶为CYP3A4、2C9、2C19、3A5，最主要的代谢酶为CYP3A4。　　(3)CYP3A1、3A11（相当于人肝微粒体中3A4）在大鼠和小鼠体内表达存在性别差异，雄性的表达量是雌性的5倍以上，导致在雄性体内的代谢高于雌性，从而引发肝毒性和药动学特征的性别差异:对雄性小鼠的肝毒性大于雌性小鼠;雄性大鼠的口服生物利用度低于雌性。　　(4) DB在肝脏内代谢活化形成反应性代谢产物引发了肝毒性。　　(5) DB极有可能是在肿瘤组织的细胞内代谢产生抗肿瘤作用的，这一假说需要用CYP3A4高表达的肿瘤细胞株进一步证实。