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刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种全球分布的机会致病性原虫，可在人和动物的所有有核细胞内寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形虫病，孕妇及免疫缺陷的患者轻度感染即可引起严重的后果。目前在弓形虫病的免疫研究方面，国内外学者大都致力于寻找和开发能有效刺激宿主产生保护性免疫应答、抵御弓形虫感染的候选抗原。三磷酸核苷水解酶(nucleosidetriphosphatehydrolase，NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面的一种主要特异性抗原，对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用，本研究将对NTPase在免疫学方面的应用进行初步的探讨。
目的：
1.构建高效原核表达载体pBAD-HisB-NTPase，采用组氨酸标签融合表达NTPase蛋白，经纯化复性后，对其生物学活性及免疫学活性进行鉴定；
2.NTPase融合蛋白免疫小鼠后，观察并研究其免疫保护性。
方法：
1.NTPase基因的克隆与表达采用PCR方法扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy载体，经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB，并转入E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达。
2.重组NTPase融合蛋白的纯化及鉴定使用Ni离子亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白，SDS-PAGE鉴定其纯度。对纯化蛋白进行透析复性后，Bradford法测定其浓度，孔雀绿钼酸铵法检测复性蛋白的ATPase活性，并使用Westernblotting和间接ELISA鉴定重组蛋白的免疫学活性。
3.重组蛋白的免疫保护研究重组NTPase蛋白和PBS分别免疫BALB/c小鼠，通过比较两组血清中的抗体生成量观察重组蛋白的体液免疫水平。使用间接ELISA检测小鼠脾细胞培养液上清中的细胞因子的含量，结合CCK-8法检测的淋巴细胞增殖结果研究重组蛋白的细胞免疫水平。
结果：
1.PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，经测序鉴定无基因突蛮。
2.成功构建原核表达载体pBAD-HisB-NTPase，SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达，表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70000，与理论值相近。经Ni2+-NTA树脂纯化后纯度约为84％。
3.复性蛋白经孔雀绿钼酸铵法测定具有良好的ATPase活性。Westernblotting和ELISA结果显示，纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清特异性识别，具有良好的免疫反应性和免疫原性。
4.初步建立了用表达的重组NTPase-Ⅱ蛋白检测弓形虫感染血清的间接ELISA方法。
5.重组NTPase蛋白可诱导机体产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答。
结论：
本实验成功构建了弓形虫NTPase基因的高效原核表达载体，所表达的融合蛋白具有良好的生物学活性和免疫学活性，作为弓形虫感染免疫诊断试剂盒的诊断抗原具有应用前景。同时，对重组蛋白的免疫保护机制进行了初步的研究和探讨，为弓形虫基因工程疫苗的研制奠定了初步的基础。