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研究背景间充质干细胞可自骨髓等多种组织分离得到,近年来,间充质干细胞移植已经成为心血管疾病,神经系统疾病等多种疾病治疗的种子细胞。研究目的本实验采用磁共振成像(MRI)进行标记细胞的体外示踪及移植细胞的糖尿病体内示踪,探讨不同浓度及时间超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记效率、标记后活力以及标记后体外成像情况,为临床体内MRI寻找最佳标记“浓度——时间”。尝试在常规1.5T磁共振(MR)的成像条件下,对较小动物兔的胰腺、肾脏等器官进行解剖成像和移植细胞的示踪;初步动态观察移植细胞在糖尿病兔体内的活体成像特点及规律,为临床干细胞移植治疗糖尿病疗效评估开创新方法。研究方法(1)MSCs的培养及鉴定。选择健康家兔,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、培养、纯化骨髓MSCs,观察细胞在光镜下的生长特征并记录其生长曲线,Von Kassa方法检测成骨诱导骨髓MSCs,对所获得的细胞进行表面抗原(CD44、CD45和CD71)的检测,确定所获细胞绝大多数为骨髓MSCs。(2)标记细胞的体外成像。配制不同浓度含SPIO的培养基(铁终浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、150μg/ml),加入骨髓MSCs孵育标记。标记后1天、3天、1周、2周、3周、4周行普鲁士蓝染色、细胞活力检测及标记细胞体外MRI,并经MRI确定合适的标记时间和标记浓度。(3)移植细胞糖尿病兔MRI活体示踪。制备兔糖尿病模型,将SPIO标记的骨髓MSCs和未标记的骨髓MSCs经静脉移植入糖尿病兔体内,用测定血糖的方法评价细胞移植前、后对糖尿病高血糖的治疗效果。同时经MR动态观察移植细胞的定位、存活及迁徙。研究结果(1)骨髓MSCs培养、鉴定:骨髓MSCs呈梭形、漩涡状生长。骨髓MSCs经成骨诱导后表达骨细胞特征。流式细胞仪表面标志鉴定CD45呈阴性,CD44、CD71呈阳性。(2)SPIO可有效标记MSCs,细胞活力检测显示时间为1天和3天时,剂量0μg/ml组与25μg/ml组,0μg/ml组与50μg/ml组,25μg/ml组与50μg/ml组的细胞拒感率没有差别(P＞0.05)。体外MRI示标记3天时,标记浓度为50μg/ml组,T2WI及T2*WI信号降低最明显。(3)建立了兔糖尿病模型,其血糖稳定＞16.8mmol/L。血糖检测显示MSCs移植可有效降低糖尿病血糖升高,MR T2WI、T2*WI序列均可示踪糖尿病兔体内移植SPIO标记骨髓MSCs。MRI可对标记细胞示踪至注射后10天。研究结论联合采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法易于分离、纯化获得纯度较高的MSCs。50μg/ml浓度,标记3天的组合不仅标记效率高,对细胞活力无影响而且细胞体外MRI信号强度降低最明显,为最适标记“浓度——时间”组合。磁标记与未标记的骨髓MSCs均能有效治疗糖尿病高血糖。临床型1.5TMR可对糖尿病兔体内标记细胞进行无创性活体示踪,并较长时间地动态观测细胞的存活与迁徙。