神经生长因子是一种神经营养因子，在神经营养因子的研究领域中一直占有领先地位，其生物学作用非常广泛，分神经系统和非神经系统两类，不仅对神经系统发育、维持神经元存活和神经损伤后的修复有重要作用，而且除神经系统外还有许多其他作用。近年来越来越多的研究发现NGF可单独或与其他生物活性因子一起作用于血管内皮细胞促进新生血管的形成。虽然NGF促进新生血管形成的作用在多个领域取得很大进展，关于NGF在视网膜血管病变新生血管形成中的作用，国内外目前没有任何研究报道。因此，本研究首次在离体细胞培养和动物及人体实验中探讨了NGF与视网膜新生血管形成的关系。 第一部分 NGF促进入视网膜血管内皮细胞增殖作用的实验研究 目的： 观察正常及缺氧条件下NGF对体外培养的人视网膜血管内皮细胞增殖的影响及其作用机制。 方法： 原代培养人视网膜血管内皮细胞并进行鉴定，取第3代的细胞进行实验。分别在正常和缺氧条件下培养细胞，用氯化钴模拟细胞化学缺氧。 1.正常、缺氧培养条件下HRCEC生长状态 取第3代HRCEC接种于96孔板，分别进行正常和缺氧培养，用MTT法检测第1、2、3、4天的细胞生长状态。 2.MTT法检测不同因子对正常和缺氧条件下培养的HRCEC的影响 取第3代HRCEC接种于96孔板，分别进行正常和缺氧培养。按下表接种后24小时加入干预培养液，于干预后第3天进行MTT检测。 3.HRCEC体外小管形成实验 取第3代HRCEC接种于Matrigel，1h后添加各种培养液，培养12h后于倒置相差显微镜下观察摄像。用Image-Pro Plus软件分析比较小管的面积。 结果： 1.正常或缺氧培养条件下HRCEC均呈现持续增长趋势，第1天2组HRCEC细胞数目无明显差别，第2天缺氧组较正常组细胞数目有增加，第3、4天数目显著增多。 2.不同因子对正常或缺氧条件下培养的HRCEC增殖的影响结果相同。1）随NGF浓度增加HRCEC细胞数目有明显增多趋势，经统计学分析NGF三组间差异有显著性意义；2） NGF+K252a组较同浓度NGF组HRCEC细胞数目减少，随K252a浓度增加HRCEC细胞数目减少趋势愈加显著，经统计学分析三组间差异有显著性意义；3）bFGF组与阴性对照组比较细胞数目明显增多，细胞数目明显多于NGF20ng/ml及NGF50ng/ml组，稍多于NGF100ng/ml组但统计学无显著性差异；4） bFGF+K252a组与bFGF组比较细胞数目无明显区别。 3.二维基质胶中毛细血管形成实验表明：1）在正常培养液HRCEC形成不完全的、松散的管状结构；2）NGF、bFGF组HRCEC形成完整的管状结构，小管面积均明显大于正常培养液组，NGF组小管面积小于bFGF组，但统计学无显著性差异；3）NGF+K252a组小管结构完整性被打破，小管面积小于NGF组；4）bFGF+ K252a组小管结构、面积与bFGF50ng/ml组比较无明显改变。 结论： 1.氯化钴诱导的细胞缺氧模型可促进HRCEC的增殖。 2.NGF促进HRCEC的增殖，该作用可被特异性TrkA阻断剂K252a所阻断。 3.NGF促HRCEC增殖作用及K252a抑制NGF的作用呈浓度依赖性。 4.NGF可在体外促进视网膜新生毛细血管管腔的形成，该作用可被K252a所阻断。 5.NGF促进HRCEC增殖和血管管腔形成的作用弱于bFGF，K252a无法阻断bFGF的作用。 第二部分 NGF在氧诱导视网膜病变小鼠中表达水平的实验研究 目的： 观察氧诱导的视网膜血管增殖模型小鼠视网膜NGF的含量变化，探讨NGF在视网膜新生血管形成中的作用。 方法： 将鼠龄为7天的C57BL/6J幼鼠连同母鼠置于含氧体积分数为75％的氧箱中连续饲养5天，在P12将其放回正常大气环境中继续饲养，使其处于相对缺氧状态，建立氧诱导的小鼠视网膜血管增殖模型。同时将同日龄小鼠置于正常空气环境中生活作为正常对照组。分别于出生后12、17、24天处死，取出双眼视网膜，用荧光定量PCR方法检测48只小鼠视网膜NGFmRNA基因的表达、ELISA检测60只小鼠视网膜NGF水平、免疫组织化学法检测24只小鼠视网膜NGF的表达。 结果： 1.正常组小鼠视网膜血管随时间发育良好。OIR组小鼠12d在中周部视网膜出现大片无灌注区，未见新生血管出现；17d小鼠视网膜新生血管大量出现，24d小鼠视网膜新生血管自行完全消退。 2.荧光定量PCR方法检测小鼠视网膜NGFmRNA基因的表达 1）17d实验组NGFmRNA表达水平最高，明显高于17d正常组及其他各实验及正常组；2）12d实验组NGFmRNA表达水平低于17、24d实验组，低于12d正常组，统计学分析无显著性差别；3）24d实验组NGFmRNA表达水平高于24d正常组，统计学分析无显著性差别；4）正常组12、17、24d间比较NGFmRNA表达水平随小鼠天数的增加而增高但组间比较，统计学分析无显著性差别。 3.ELISA检测小鼠视网膜NGF蛋白表达水平结果分析同荧光定量PCR方法检测结果。 4.免疫组织化学法检测小鼠视网膜NGF的表达 NGF阳性表达产物均呈棕褐色，定位于细胞浆，细胞核一般不着色。阳性表达产物主要见于内丛状层、神经节细胞层及神经纤维层，其中以神经节细胞层表达最为明显。出生后第17天，OIR组表达强度显著高于对照组，其他各组无明显区别。 结论： 1.缺氧是视网膜新生血管发生的主要原因。 2.视网膜新生血管形成时内源性的NGF表达上调，新生血管消退则NGF表达下降。 3.NGF水平变化与视网膜新生血管形成有着密切的关系，内源性的NGF可能参与并促进了局部缺血视网膜组织的新生血管形成过程。 第三部分 NGF促进氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管生成的实验研究 目的： 观察NGF眼内注射对氧诱导的视网膜新生血管形成的作用。 方法： 建立OIR小鼠模型，选取P12出氧箱时常规双眼前后节检查均无异常者随机分为4组：NGF注药组、bFGF注药组、NGF+bFGF组、K252a注药组，每组各15只。均以右眼为注药眼，左眼作为自身对照眼。所有小鼠左眼除K252a组注射微量DMSO加生理盐水外均玻璃体腔注射生理盐水作阴性对照。P17处死小鼠，荧光素灌注视网膜铺片检测视网膜新生血管和无荧光素灌注区面积，视网膜石蜡切片HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。 结果： 1.视网膜铺片检测无灌注面积的变化 1） NGF、bFGF及混合注药组注药眼视网膜铺片无灌注区面积小于对照眼，统计学分析有显著性差异；2）K252a组注药眼视网膜铺片无灌注面积与对照眼比较无明显差别；3） NGF、bFGF及混合注药组注药眼间比较视网膜铺片无灌注区面积无明显差别，三组注药眼视网膜无灌注面积均小于K252a组注药眼，统计学分析有显著性差异。 2.视网膜铺片检测新生血管面积的变化 1） NGF、bFGF及混合注药组注药眼视网膜铺片新生血管面积大于对照眼，统计学分析有显著性差异；2）K252a组注药眼视网膜铺片新生血管面积小于对照眼，统计学分析有显著性差异；3）NGF、bFGF及混合注药组注药眼间视网膜铺片新生血管面积比较：NGF+bFGF注药眼＞bFGF注药眼＞NGF注药眼，组间比较P值均＜0.05，统计学分析有显著性差异。 3.视网膜切片检测新生血管的定量结果统计学分析同视网膜铺片检测新生血管面积的变化。 结论： 1.NGF、bFGF可促进OIR小鼠缺血视网膜组织的新生血管形成，NGF促血管形成作用弱于bFGF。 2.NGF和bFGF具有协同刺激OIR小鼠缺血的视网膜组织新生血管形成的作用。 3.K252a可抑制OIR小鼠视网膜新生血管的形成，原因可能是其与视网膜血管内皮细胞的TrkA特异性结合阻断了视网膜内源性NGF的生血管作用。 第四部分 NGF在糖尿病视网膜病变患者外周血中表达水平变化的研究 目的： 探讨NGF是否参与和促进糖尿病视网膜病变新生血管的形成。 方法： 研究对象分四组：正常健康组20例，糖尿病无视网膜病组50例，非增生性糖尿病视网膜病变组50例，增生性糖尿病视网膜病变50例，收集临床资料：年龄、糖尿病类型、糖尿病病程、收缩压、舒张压、糖化血红蛋白、尿素氮、肌酐，采用酶联免疫吸附测定法检测外周血血浆NGF含量。 结果： PDR患者血浆中NGF水平高于CG组、NDR组、NPDR组，比较差异有统计学意义。血浆NGF水平与糖尿病病程、HbA1c有正相关性。 结论： 糖尿病视网膜病变患者的外周血NGF水平升高，并与糖尿病病程、HbA1c的水平成正相关。糖尿病视网膜病变患者的外周血NGF水平的升高，可能参与促进了视网膜新生血管的形成。