新抗虫基因Cry1AB13-2的克隆及其在大豆中的遗传转化和功能鉴定

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:shawn200904
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我国大豆生产每年受虫害的影响非常严重。虫害不仅能导致大豆产量大面积的减产;而且对大豆品质的影响也十分巨大。传统化学防治虫害的方法不仅对环境会造成严重的污染;与此同时还会影响大豆的食品安全。  因此;以转基因生物技术手段的分子育种方式开始受到育种家们的青睐。其中以Bt(Bacillus thuringiensis;Bt)抗虫基因率先被运用于作物的育种当中;取得了不错的抗虫效果;并且很快商业化。通过转基因技术;将Bt抗虫基因导入作物当中;使其表现抗虫性。这类通过分子技术选育抗虫品种以达到抗虫效果的方式相比传统化学杀虫方式对环境危害更小。  本试验通过易错PCR克隆获得Cry1AB13-2基因并对其构建表达载体;成功导入受体大豆品种“吉农28”中;并对其进行了抗虫性功能鉴定。本试验初步验证了Cry1AB13-2新抗虫基因具有对大豆食心虫显著的杀虫活性。通过抗虫性功能鉴定;选育出转Cry1AB13-2基因的抗虫优良品系;从而为转基因抗虫品种的选育提供数据参考。本试验主要获得的结果如下:  1.通过易错PCR将Cry1AB13质粒DNA进行诱导突变;最终克隆获得Cry1AB13-2新基因。  2.分别构建克隆载体pMD-18T-Cry1AB13-2、表达载体pCAMBIA3300-Cry1AB13-2。并利用农杆菌介导法以及花粉管通道法成功将植物重组过表达载体导入受体大豆品种“吉农28”中。经常规PCR检测获得T0阳性植株5株、T1阳性植株18株。  3.以Bar基因作为探针;分别对农杆菌介导法和花粉管通道法共同获得的转基因阳性植株进行了Southern blotting鉴定;其中12株出现杂交信号;并以单拷贝形式整合到了“吉农28”大豆基因组当中。  4.荧光定量PCR检测结果显示目的基因Cry1AB13-2在根、茎、叶3个部位均有表达;其中3株目的基因在各个部位相对表达量的平均值分别为:1.64、3.34、6.87。可以看出该基因在大豆根、茎、叶3个部位的相对表达量呈现出依次递增的趋势;其中在叶中的表达量最高。  5.室内抗虫性鉴定结果显示:转Cry1AB13-2基因株系豆荚内大豆食心虫的成活数量明显低于受体材料吉农28大豆豆荚内的活虫数量;并且受体材料相较于转化株系叶片对斜纹夜蛾的感虫指数更高。  6.室外抗虫性鉴定结果显示:转化株系虫食率为3.23%;属于抗虫级别(R-抗;2-4%);非转化株系虫食率为6.72%;属于感虫级别(S-感虫;6-10%)。
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