目的探讨EBV-BARF1基因对胃上皮细胞增殖能力的影响,为进一步阐明EBV相关胃癌的发生机制奠定基础。方法(1)根据GenBank提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,用RT-PCR扩增BARF1的ORF,克隆至pGEM-T载体,转化大E.coli DH5α,双酶切鉴定筛选阳性克隆,进行序列测定。再将其插入真核表达载体pSG5中,转化宿主菌E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选和双酶切鉴定插入方向。(2)将重组表达质粒pSG5-BARF1及pSG5载体对照以脂质体法转染胃癌细胞系SGC-7901,以RT-PCR法检测目的基因BARF1的表达。(3)以pSG5载体转染细胞为对照,用细胞计数法测定BARF1表达细胞的增殖状况。结果(1)RT-PCR扩增获得696bp的BARF1基因ORF,经限制性酶切鉴定证实成功插入pGEM-T载体中。经双酶切鉴定和DNA序列测定证实成功构建真核表达载体pSG5-BARF1。(2)RT-PCR证实pSG5-BARF1转染的胃癌细胞系SGC-7901表达BARF1的mRNA。(3)细胞计数法证明表达BARF1的SGC-7901比pSG5载体转染对照细胞增殖速度加快。结论1.成功克隆了EBV的BARF1基因。2.构建了真核表达载体pSG5-BARF1。3.pSG5-BARF1可在胃癌细胞系SGC-7901中转录BARF1mRNA。4.BARF1的基因可以显著增强SGC-7901细胞的增殖能力。