论文部分内容阅读
α-酮戊二酸脱氢酶复合物是三羧酸循环的关键酶，是由三个基因编码的几十个亚基组成的大分子酶蛋白。三个基因分别为sucA，sucB和lpdA。其中sucA编码α-酮戊二酸脱氢酶，sucB编码二氢硫辛酸转琥珀酰酶，lpdA编码二氢硫辛酸脱氢酶，三种亚基分子量大小分别为94,000D、47,000D和54,000D，通过非共价键结合在一起。具有天然活性的仅．酮戊二酸脱氢酶复合物的亚基组成为：12个α-酮戊二酸脱氢酶链，24个二氢硫辛酸转琥珀酰酶链以及12个二氢硫辛酸脱氢酶。实验表明，24个二氢硫辛酸转琥珀酰酶链可以结合6个α-酮戊二酸脱氢酶二聚体和18个二氢硫辛酸脱氢酶二聚体。然而，只有在结合6个二氢硫辛酸脱氢酶二聚体时α-酮戊二酸脱氢酶复合物才表现出最大的活性。
本文通过文献检索获得已发表的大肠杆菌K12全基因组序列，然后以此为依据设计α-酮戊二酸脱氢酶复合物基因引物，以大肠杆菌K12染色体DNA为模板，用PCR技术分别扩增了编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的基因序列sucAB和lpdA。PCR产物纯化后，sucAB用EcoR I和Sal I双酶切，lpdA用Sal I和Hind Ⅲ双酶切，分别与经过相同酶切处理的质粒pUC18连接，连接产物转化大肠杆菌Ecoli JM109，在含有氨苄青霉素抗性的麦康凯培养基平板上筛选到阳性转化子。经过提取质粒和酶切验证后，初步证明连接成功。将构建好的质粒pUC18-sucAB和pUC18-lpdA送上海博亚生物技术有限公司进行测序后，证明克隆得到的基因序列与所发表的大肠杆菌K12全基因组序列中相关序列相同。为了使编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物各基因串连表达，将质粒pUCl8-sucAB和pUC18-lpdA均用EcoR I和Sal I双酶切，然后回收所需的片断，用T4DNA连接酶进行连接，得到了目标质粒pUC18-sucAB-lpdA，连接产物转化大肠杆菌E.coliJM109，在含有氨苄青霉素抗性的麦康凯培养基平板上筛选阳性转化子。经过提取质粒和酶切验证后，证明各基因串连连接成功。大肠杆菌JRG301和JRG465均为a-酮戊二酸脱氢酶基因缺陷型菌株，两者中编码a-酮戊二酸脱氢酶复合物的部分基因分别被突变，其中JRG301编码的 lpdA基因发生突变，JRG465中编码的sucA基因发生突变，菌株从而无法依靠自身基因编码出完整的具有活性的a-酮戊二酸脱氢酶复合物。为了验证我们构建的质粒pUC18-sucAB，pUC18-lpdA和pUC18-sucAB-lpdA在大肠杆菌中的表达活性，将质粒pUC18-sucAB转化JRG465缺陷型菌株，质粒pUC18-lpdA转化JRG301缺陷型菌株，质粒pUC18-sucAB-lpdA同时转化JRG465和JRG301两种缺陷型菌株。成功获得各转化子后，分别大量培养获取细胞，用超声波法破碎细胞，得到转化子细胞的胞内上清液，测定a-酮戊二酸脱氢酶复合物的酶活性，同时用大肠杆菌野生型K12、不含质粒的缺陷型菌株JRG301和JRG465作为对照。在JRG465(pUC18-sucAB)中测得活性，可以证明基因sucAB的表达。在JRG301(pUC18-lpdA)中测得活性，可以证明基因lpdA的表达。在JRG465(pUC18-sucAB-lpdA)和JRG301(pUC18-sucAB-lpdA)中都测得酶活性，可以证明串联基因sucAB-lpdA均得到了表达。结果表明，在转化后的大肠杆菌a-酮戊二酸脱氢酶基因缺陷型菌株JRG465和JRG301中，均测得比较高的a-酮戊二酸脱氢酶活性，且其表达量明显比大肠杆菌野生型K12高，这可能是由于载体质粒pUC18的多拷贝所导致的，证明克隆基因在自身启动子的带动下，在大肠杆菌中能够得到很好的表达，为下一步在硫细菌中的表达奠定了坚实的基础。为了进一步证明克隆基因确实在大肠杆菌仅．酮戊二酸脱氢酶基因缺陷型菌株JRG465和JRG301中得到了表达，我们用JRG465(pUC18-sucAB-lpdA)
和JRG301(pUCl8-sucAB-lpdA)菌株破碎细胞后的上清液进行了SDS-PAGE电泳，并用不含质粒的缺陷型菌株JRG465、JRG301以及大肠杆菌野生型K12作为对照，结果表明,在预期出现条带的94，000D、47，000D和54，000D处，含有质粒的缺陷型菌株以及野生型K12均出现了比较明显的条带，而对照的缺陷型菌株则没有此对应条带，且在含质粒的大肠杆菌α-酮戊二酸脱氢酶基因缺陷型菌株中，其条带亮度明显大于大肠杆菌野生型K12，这一结果与酶活测定的结果相符合。但是lPdA和sucB基因编码的两种蛋白，由于其分子量只相差7,000D，其分离效果并不理想，但从其与sucA基因编码的分子量为94，000D的蛋白亮度分析，后一条带应该为lpdA和sucB基因编码的两条蛋白重合所致。α-酮戊二酸脱氢酶复合物基因的克隆与在大肠杆菌中的表达研究，为在硫细菌中引入该基因，在硫细菌这种自养菌中构建完整的TCA循环，改善硫细菌的能量代谢状况，获得最佳生长特性的基因工程菌，从而提高采矿生产效率奠定了基础，具有重要的意义。