论文部分内容阅读
恶性肿瘤是危害人类生命健康最严重的疾病。化疗作为治疗恶性肿瘤的主要手段之一，是治疗晚期恶性肿瘤以及防止复发必不可少的。临床应用化疗治疗血液系统恶性肿瘤已取得较好的疗效。然而，对于占恶性肿瘤90%以上的实体瘤，化疗尚未能取得满意的效果。且化疗药物对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差，对人体往往产生一定的毒副作用。因此，继续寻找高效、特异和低毒的抗肿瘤药物是肿瘤防治研究中的重要课题。天然产物凭借其来源广泛、类型多样、不良反应小，具有开发为化疗药物增效减毒辅助药物的潜力等特点备受关注。二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）具有多种生理活性，来源广泛，在显齿蛇葡萄“藤茶”茎叶中具有很高的含量，近年来对其在抗肿瘤方面的应用日益受到关注，为了真正实现物尽其用，进一步系统研究其抗肿瘤作用及相关机制等是非常必要的。目前对DMY的抗肿瘤作用研究主要集中在几种肿瘤细胞的离体抗增殖作用，对其抗肿瘤作用机制表述不一，且缺乏活体实验的证据，不利于临床应用。针对上述问题，本课题以显齿蛇葡萄“藤茶”中提取的活性成分DMY为材料开展了以下系列研究。MTT结果显示三株人乳腺癌细胞对DMY的敏感性依次为MDA-MB-231＞MCF-7/A＞MCF-7。处理48h，DMY对MDA-MB231细胞的增殖抑制表现出剂量依赖关系，其IC50为73.6μg/mL；而对人胚肾细胞HEK-293和人肝细胞L-02的IC50分别为475.3和324.8μg/mL。40和80μg/mLDMY能诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞于G2/M期，增加细胞的晚期凋亡率，并减少其分泌的明胶酶活性。这些结果表明，DMY的抗肿瘤作用具有较强的细胞选择性，其抗肿瘤作用机制可能与细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导和侵袭转移抑制有关。细胞形态学观察、DAPI染色以及Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测结果显示DMY能以浓度依赖方式诱导MDA-MB-231细胞凋亡。Fluo-3-AM染色分析、JC-1染色结合流式细胞术检测以及Western印迹分析结果进一步显示DMY诱导MDA-MB-231细胞凋亡伴有胞内游离钙离子浓度升高，线粒体跨膜电位（ΔΨm）降低和Caspase-3和Capase-9蛋白表达上调，表明DMY能够通过线粒体途径诱导MDA-MB-231细胞凋亡。划痕实验和Transwell细胞侵袭实验结果进一步表明DMY能够不依赖细胞毒作用抑制MDA-MB-231细胞的侵袭转移。Real-time PCR结果显示，20、40和80μg/mL DMY处理48h，MDA-MB-231细胞转移相关基因MMP-9和MMP-2mRNA的表达量变化明显大于其他转移相关基因TIMP-2、VEGF和TGF-β1mRNA的表达量变化，但未见明显浓度梯度关系。Western blot分析结果显示20、40和80μg/mL的DMY能以剂量依赖方式减少MMP-2/-9蛋白表达水平。DMY对MDA-MB-231细胞的侵袭抑制机制与其下调MMP-2/-9蛋白表达水平正相关。DMY也能以剂量依赖方式抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖，处理48h的IC50为102.1μg/mL。DMY能不依赖细胞毒作用而抑制小鼠乳腺癌细胞4T1的迁移和侵袭；DMY抑制4T1细胞侵袭的机制与其下调MMP-2/-9蛋白表达水平相关，其抑制4T1细胞增殖的机制与S期阻滞、凋亡诱导和侵袭转移抑制有关。中效原理分析显示，当抑制效应（Fraction affected, fa）≤0.75时，DMY联合阿霉素作用于MDA-MB-231细胞为协同效应；抑制效应≤0.6时，DMY联合阿霉素作用于4T1细胞为协同效应，在相同的抑制效应下可明显降低DMY和阿霉素单用时的使用剂量。最后我们建立Balb/C雌性小鼠乳腺癌肺转移模型，观察活体条件下DMY对乳腺癌细胞的抗增殖和抗转移作用。结果发现：与对照组相比，100mg/（kg d）DMY给药组荷瘤小鼠瘤重、肺转移灶数以及血浆微转移数明显低于50mg/（kg d）DMY给药组，且未见明显毒副作用。2mg/（kg d）ADM给药对乳腺癌细胞4T1细胞的生长和转移有更显著的抑制作用，但血清生化分析、脾脏指数测定和HE组织染色结果表明ADM给药伴随明显的心、肝毒性和免疫抑制。100mg/（kg d）DMY与2mg/（kg d）ADM联合给药对肿瘤细胞的生长和转移的抑制作用强于二者单独给药组，此外联合组小鼠肿瘤组织中瘤细胞密度明显低于二者单一给药组，且伴随更多的坏死灶和更少的血管。联合给药荷瘤小鼠血清LDH、CK、ALT和AST水平明显低于2mg/（kg d）ADM组，且联合给药组肿瘤组织可见明显粒细胞的浸润，而ADM给药组未见明显粒细胞浸润。这些结果表明：活体条件下DMY给药能抑制小鼠乳腺癌细胞的生长和转移，且具有低毒性；阿霉素对小鼠移植性乳腺癌4T1生长和转移有显著的抑制作用，但是伴随一定程度的心、肝毒性和免疫抑制作用；DMY与阿霉素联合用药具有协同增效和减毒作用。