论文部分内容阅读
水稻纹枯病是水稻生产上最重要的三大病害之一,每年造成严重的经济损失。纹枯病是由丝核菌属真菌引起的水稻茎干和叶鞘病害的统称,包括Rhizoctonia solani Kühn、Rhizoctonia oryzae和Rhizoctonia oryzae-sativae等,不同真菌在培养性状、引起的病害在症状和危害部位上稍有差别。前期的研究发现分离自水稻纹枯病病斑的10个产菌核的真菌菌株培养性状有明显的差异,因此本文对它们进行了系统的生物学性状和遗传多样性的比较研究,以期为源自水稻的不同丝核菌菌株的多样性提供知识积累。生物学性状的研究主要包括菌落形态、核型、菌丝直径和对水稻的致病性,不同pH值、温度、碳源、氮源等培养条件对各菌株生长的影响等。结果表明菌核在固体培养基上的分布方式主要有3种:随机分布如rcol、wh-68、wh-79、B-10和wh-81,分布于培养皿中如wh-87、wh-81和wh-62,分布于培养皿边缘如wh-1和wh-94。有性阶段属于瓜亡革菌(Thanatephorus sp.)的菌株wh-1和wh-94的核型为多核,有性阶段属于角担菌的wh-87、wh-81、wh-90和wh-62为双核。Wh-68、wh-79和B-10为双核,而Rcol为杂核,即绝大多数为双核,部分细胞为多核甚至单核。多核类丝核菌wh-1和wh-94的菌丝直径明显大于wh-87、wh-81、wh-90和wh-62等双核菌。不同菌株对水稻的致病性存在显著差异,以wh-1和wh-94最强,而Wh-68、wh-79和B-10对供试的水稻品种基本无致病性。不同菌株在pH 6.0-7.0、25℃-30℃条件下,生长速度最快。在含淀粉、脯氨酸、硫铵酸、甘氨酸或丙氨酸的的查彼克(czapek)固体培养基上生长速度最快,在含乳糖和赖氨酸的查彼克培养基上生长速度最慢。在最适宜的碳源、氮源条件下,各菌株的生长速度、菌核形成数目、菌核干重趋于一致。wh-68、wh-79和B-10在PDA平板上产生如针头大小的微菌核,与其他的菌株存在显著差异,仅由形态学很难确定其分类地位,所以对其进行了分子鉴定。wh-68的18S rDNA与Rhizoctonia sp.AG-A同源性98%,与Ceratobasidium sp同源性99%。扩增结果表明,ITS序列与Sclerotium hydrophilum 100%同源,所以确定其为稻球小菌核病菌(Sclerotium hydrophilum Sacc),也称为喜水小核菌(球小菌核),属半知菌亚门真菌。水稻丝核菌菌株的遗传多样性的研究采用了RAPD技术。通过对模板DNA浓度、Taq酶、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、以及变性时间、循环次数、退火温度等因素的探索,确定了优化的RAPD反应体系。利用优化好的引物从s300-s399(上海sangon)共筛得到62条扩增条带清晰、谱带丰富的引物。利用62条随机引物对供试的7个菌株进行扩增,共获得591个RAPD标记。其中多态性标记537个,占90.86%。聚类表明表明当相似系数为0.55时可将供试菌株分为2个类群,其中第一类群为为单一的一个类群,包括菌株wh-1和wh-94,第二类群包括三个亚类群,分别为第一亚类群(Rcol和wh-87)和第二亚类群(wh-62、wh-81和wh-90),聚类结果与其生物学特性基本符合。菌株Rcol含有两种类型的ITS,即Ceratobasidium oryzae-sativae AG-Bb和Thanatephorus cucumeris AG-1-IA的ITS。s393对wh-94和Rcol的扩增也发现了一条wh-87(Ceratobasidium sp.)缺少而wh-94(Thanatephorus)和Rcol同时具备的特征带,序列分析表明为Thanatephorus sp.18S rDNA部分序列。为Rcol菌株是杂合菌株提供了进一步的证据。