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稀有海洋放线菌是从闽江深海中分离得到的,主要用于医用抗生素研究的放线菌。为了将该菌株开发利用于农林业等其他非医药领域,本研究筛选对松材线虫具有击倒活性的高效菌株,并对目标菌株的培养基配方和培养条件进行优化,以提高其杀线虫活性,同时对活性较强的菌株11进行了形态学和分子生物学初步鉴定。1、在室内采用链格孢菌(Alternaria)培养繁殖线虫的基础上,尝试筛选其他可供线虫取食真菌,结果率先发现荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)和疣孢霉菌(Mycogone perniciosa magn)可作为线虫食料,28℃ PDA培养基上培养10d繁殖倍数分别为64.50和63.20。2、以松材线虫为靶标生物,以放线菌菌株发酵粗提液为初筛溶液,采用96孔板生测法筛选196个粗提放线菌样品,测定其在不同浓度不同处理时间下松材线虫死亡率情况,结果发现总体杀线虫活性比较高,5%低浓度分别处理12 h和24 h死亡率大于80%的样品数分别达总样品数的50%和77.94%,最后确定6株高效菌株进行复筛。分别用有机培养基和无机培养基对菌株进行模拟实际应用发酵并测定活性,最后选取菌体生长速度快、活性较为稳定的菌株11作为目标菌株进行下一步优化鉴定。3、经过形态鉴定、培养基特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析,将菌株11初步鉴定为小单孢菌(Micromonospora),16SrDNA测序分析结果与青铜小单孢菌(M.chalcea)(1464-217 L)序列相似性达 99%。4、通过单因子实验、均匀设计实验和响应面优化得到放线菌菌株11最佳培养基配方和最佳培养条件:(1)单因子法得到最适碳源、氮源、培养时间、接种量、装液量、初始 pH 分别为可溶性淀粉、酵母粉、96h、12%、60mL/250mL、7.2-7.5。(2)Plackett-Burman设计筛选得到主效因子分别是:碳酸钙浓度(0.29g/L),装液量(55mL),氮源浓度(7g/L)。(3)通过一次正交回归设计、响应面优化设计得到最佳活性下培养基成分和培养条件为:可溶性淀粉(20g/L)、酵母粉(25g/L)、氯化钠(0.5g/L)、磷酸氢二钾(0.5g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、碳酸钙(0.38g/L)、温度(28 ℃)、初始pH(7.2)、培养时间(96 h)、接种量(10%)、装液量(72 mL/250 mL),发酵上清液杀线虫死亡率为:99.2%,沉淀杀线虫死亡率为97.54%,菌体的生物量为2.16 g,接近预测值。同时,辅以均匀设计:优化条件x1(可溶性淀粉浓度)=10g/L,x2(酵母粉)=1 g/L,x3(磷酸氢二钾)=0.1g/L,x4(氯化钠)=0.1g/L,x5(硫酸镁)=0.1g/L 时,y1(上清液致死率)=98.06%,y2(胞内物质致死率)= 86.35%,y3(生物量)=0.9236 g。比较两种优化方法,响应面优化法原料成本较高,但效果较后者优,总的来说,两种方法优化结果均理想,均表明菌株具有稳定的产生杀线虫活性物质的能力,具有开发价值。