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鸡球虫病是一种由艾美耳属的球虫寄生在鸡肠道引起的原虫病,该病呈世界性分布、感染率高、危害性大。其中尤其以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)致病力最强、造成的损失最为严重。目前鸡球虫病的防治主要依靠药物和少数几种活苗,但药物防治存在的耐药性和药物残留问题以及活苗存在的毒力返强、散毒等风险使得业内迫切需要研制一种新型的鸡球虫疫苗。本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子表面蛋白TA4基因为抗原分子,以甲病毒复制子载体pSMART2b为真核表达载体,串联鸡细胞因子IL-2作为佐剂,构建了重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2,确定重组质粒p SMART2b-TA4-IL-2诱导鸡的免疫应答和抗柔嫩艾美耳球虫保护效果,最后对该疫苗进行了安全性评价。重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2的构建、表达和鉴定首先PCR扩增EtTA4和鸡IL-2基因,然后融合PCR扩增TA4-IL-2基因并连接至pMD18-T克隆载体,最后将TA4-IL-2基因连接至pSMART2b载体。重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定正确后将重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2转染至293T细胞后经Western blot分析其表达。同时构建pSMART2b-TA4和pSMART2b-IL-2作为对照。结果表明,扩增EtTA4与IL-2基因长度分别为687bp和429bp。PCR、双酶切和测序确定构建了重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2。Western blot结果显示在76KDa左右处出现明显条带,且条带大小与预期相符,表明该重组质粒能够在细胞中表达并被鸡抗柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别。重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2诱导鸡的免疫应答将构建的重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2、pSMART2b-TA4和pSMART2b-IL-2按照25μg/羽的免疫剂量和7日龄首免、14日龄与21日龄各加强免疫一次的免疫程序以及腿部肌注的方法免疫鸡只。ELISA法测定免疫后各组鸡只的抗体水平和细胞因子水平,MTT法测定T淋巴细胞增殖水平。结果表明,在细胞因子IL-2与IFN-γ水平上,pSMART2b–TA4-IL-2免疫组与p SMART2b-IL-2对照组相比差异极显著(P<0.01),pSMART2b–TA4-IL-2组较pSMART2b–TA4对照相比差异不显著(P>0.05)。在抗体水平上,pSMART2b–TA4-IL-2免疫组与pSMART2b–TA4组差异不显著(P>0.05),在T淋巴细胞增殖水平上,pSMART2b–TA4-IL-2免疫组较pSMART2b-TA4和p SMART2b-IL-2对照组相比升高明显(P<0.05)。重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2抗柔嫩艾美耳球虫保护效果重组质粒免疫鸡只后进行攻虫试验,测定各组存活率、增重效果、盲肠病变计分、卵囊数,以抗球虫指数(ACI)评价重组质粒的保护效果。结果表明,pSMART2b-TA4-IL-2免疫组和pSMART2b–TA4与p SMART2b-IL-2对照组相比,体重增加、盲肠病变减轻、卵囊数较少。ACI达到186.62,显示良好的抗球虫保护效果。重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2的安全性评价按照《农业转基因生物安全管理条例》的规定,对重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2的安全性进行了评价。评价指标包括疫苗单剂量反复接种和超剂量单次接种条件下靶动物临床反应的变化、血液学指标的变化、主要脏器病变情况的观察以及重组质粒的抗原基因在动物体内残留时间的测定。环境安全评价指标主要包括受试点周围水体的检测以及靶动物粪便的检测。结果在4个月的受试期内,重组质粒无论在单剂量还是超剂量接种下,各实验组均未出现动物临床表现的异常。对各组靶动物的主要脏器制作病理切片后观察,结果与阴性对照组的健康组织相比,未见明显的病理变化。PCR法对抗原基因在靶动物体内的残留情况进行了测定,结果在免疫后2月内,可以检测到TA4基因的存在,而在2个月以后,各组受试动物的各个组织均检测不到TA4基因,说明TA4基因并未整合到宿主染色体内。同时对受试点周围的水体以及动物粪便进行了PCR检测,也均未检测到TA4基因。上述安全性评价结果说明,重组质粒pSMART2b-TA4-IL-2对靶动物和环境有较高的安全性。