基于磷酸氢钙的有机—无机杂化纳米材料在生物分析检测中的应用

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在生物分析检测中,酶法分析是一类较为常见的分析检测方法。如酶联免疫吸附试验(ELISA),它就是一种基于酶来进行信号放大的特异性的免疫检测方法。但是,由于通常一个酶分子只结合一个分子的分析物。这会限制其检测灵敏度的提高。而纳米材料可以在一个纳米颗粒上同时结合多个酶分子和识别分子,所以纳米材料可以用作载体实现其信号放大和灵敏度的提高。本论文以基于磷酸氢钙(CaHPO4)的有机-无机杂化的纳米材料为研究对象,并将这种纳米材料应用于大肠杆菌、沙门氏菌和凝血酶的分析检测中。论文分为五章:第一章,介绍了纳米材料、生物传感器、并讨论了纳米材料在病原菌和蛋白检测中的应用,最后简要介绍论文选题背景和内容。第二章,以伴刀豆球蛋白A(ConA)作为识别单元,葡萄糖氧化酶(GOx)作为信号放大单元,以CaHPO4作为为无机载体材料,通过生物仿生的合成方法制备成ConA-GOx-CaHPO4(CGC)有机-无机杂化纳米材料。该方法不仅简单,没有繁琐的操作和纯化步骤,材料仅一步就能合成并同时具有识别和信号放大功能,而且合成过程绿色,无需任何有害的化学试剂或合成条件。我们首次将这种材料与手持式pH计结合起来,应用到便携式检测大肠杆菌0157:H7中。检测限为10CFU/mL。检测范围为10-106CFU/mL。第三章,以伴刀豆球蛋白A(Con A)作为识别单元,用蔗糖酶(Invertase)作为信号放大单元并利用Ca2+对蔗糖酶酶活力的促进作用,制备成ConA-Invertase-CaHPO4(CIC)有机-无机杂化纳米材料。不仅固定在CIC中的蔗糖酶和Con A展现了很高的稳定性,而且固定在CIC中蔗糖酶活力提高了 203.5%。我们首次将该材料与血糖仪结合起来,对大肠杆菌0157:H7进行便携式的检测。检测限为10CFU/mL。检测范围为10-105CFU/mL。第四章,以抗体(Ab)作为识别单元,用辣根过氧化物酶(HRP)作为信号放大单元,制备成Ab-HRP-CaHPO4(AHC)有机-无机杂化纳米材料,并成功应用于肠炎沙门氏菌的检测中。扩展了基于CaHPO4的有机-无机杂化纳米材料的应用范围,让这种有机-无机杂化纳米材料应用到所有基于免疫反应的检测成为了可能。同时结合了免疫磁珠分离法和化学发光法,不仅减少了操作步骤和检测时间,而且提高了检测的灵敏度。检测限为1CFU/mL。检测范围为1-105 CFU/mL。第五章,以核酸适配体(Aptamer)作为识别单元,制备成Aptamer-HRP-CaHPO4(APHC)有机-无机杂化纳米材料。这种杂化纳米材料把将核酸和蛋白有效的固定在一起并且一步就能完成制备,同时也将这种杂化纳米材料成功应用于凝血酶的检测中,更大的扩展了基于CaHPO4的有机-无机杂化纳米材料的应用范围,让这种有机-无机杂化纳米材料能应用到所有基于核酸适配体的检测成为了可能。由于核酸适配体合成较为廉价,且不易受温度、pH等因素的影响,所以大大降低制备的这种材料的成本同时也提高了它的稳定性。该方法检测限为9 pM。检测范围为 0.01-137 nM。综上所述,本项博士论文工作以基于CaHPO4的有机-无机杂化的纳米材料为研究对象,系统地开展了该类纳米材料在生物检测中的应用研究,检测的对象包括大肠杆菌、沙门氏菌和凝血酶,所建立的技术和方法经实验验证获得圆满成功。
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