论文部分内容阅读
研究背景心肌梗死（myocardial infarction,MI）严重威胁着人类的健康,而且发病率呈上升的趋势,患者年龄也逐渐年轻化。恶性室性心律失常（ventricular arrhythmias,VAs）及心源性猝死（sudden cardiac death,SCD）是 MI 患者致死、致残的重要原因。近年来一系列研究及我们既往研究证实MI后恶性Vas及SCD与心脏交感神经再生重构导致的心脏自主神经失衡引发心电不稳定有关。因此探索MI后交感神经重构的具体机制将为降低Vas及SCD发生率、改善远期预后提供防治措施和理论依据。交感神经再生重构与炎症反应密切相关。交感神经重构主要发生在炎症细胞和炎症因子等大量聚集的梗死灶周,炎症细胞（巨噬细胞、成纤维细胞等）通过分泌神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对交感神经重构起着关键性调控作用。在交感神经重构的过程中,NGF是不可或缺的重要因子,抑制NGF分泌可有效降低交感神经过度重构,其调控机制未完全阐明。近年研究显示,长链非编码RNA（long Non-coding RNA,lncRNA）虽然不编码蛋白,但其可在组织生理生化发生变化时,与DNA、RNA或蛋白质相互作用,通过基因印记、染色质重塑等机制调控基因表达。lncRNA H19是一种目前研究较多的lncRNA,多项研究已证实,lncRNA H19参与肿瘤、炎症、代谢相关疾病的发生、发展过程,并成为有效治疗靶点。在心血管领域,lncRNA H19已被发现参与动脉粥样硬化、肥厚性心肌病以及心力衰竭等疾病的病理生理过程。lncRNA H19是否参与MI后交感神经再生重构过程尚不得而知。lncRNA H19可作为多种miRNA的“海绵”（miRNA sponge）,通过序列互补结合miRNA,进而控制miRNA的数量及活性,调控其靶基因的表达水平。通过生物信息学分析网站RNAhybrid和Targetscan,我们预测到lncRNA H19及NGF均是miR-let-7a的靶基因,课题组前期研究也发现过表达miR-let-7a可抑制NGF的表达,进而改善了 MI后交感神经重构。因此我们提出假说:MI后过表达的lncRNA H19可能通过结合miR-let-7a发挥miRNA海绵（miRNA sponge）作用,通过ceRNA机制减少了 miR-let-7a对其靶基因NGF的抑制作用,NGF表达增加,进而促进心脏交感神经损伤后的再生重构。干预lncRNA H19-miR-let-7a-NGF信号通路将为MI后室性心律失常的防治提供新靶点。研究目的我们旨在探讨lncRNA H19、miR-let-7a和NGF在MI后的调控关系,以及是否参与MI后交感神经重构和可能的机制。研究方法实验一:为明确MI后7天lncRNA H19和NGF的表达情况,将14只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（260-280g左右）分成心肌梗死组和假手术组,每组7只。Western blotting和qRT-PCR检测NGF和lncRNA H19的表达差异。心肌梗死组心梗模型结扎其左冠状动脉前降支;假手术组只在相应冠脉部位穿线但不打结。实验二:为了研究lncRNA H19、NGF和MI后交感神经重构的调控关系,将32只SD大鼠随机分为4组:假手术+对照病毒组、假手术+lncRNA H19沉默病毒组、心肌梗死+对照病毒组、心肌梗死+lncRNA H19沉默病毒组,每组8只。在MI手术当天,将lncRNA H19沉默慢病毒或对照病毒注射入左心室心肌。在MI后7天处死之前,进行程序电刺激实验检测心律失常易感性;然后取出心脏和血液进行 western blotting,ELISA 检测 NGF 表达,qRT-PCR 检测 lncRNA H19 表达情况;交感神经再生情况则通过免疫荧光实验观察梗死灶周生长相关蛋白43（growthassociatedprotein43,GAP43）和酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）的阳染面积进行分析。实验三:为了验证沉默lncRNA H1 9通过调控NGF表达而抑制MI后交感神经重构,将24只SD大鼠随机分为心肌梗死+对照病毒组、心肌梗死+lncRNA H19沉默病毒组和心肌梗死+lncRNA H19沉默病毒+NGF过表达病毒组,每组8只,进行回复实验。采用Western blotting和免疫荧光实验检测梗死灶周NGF的表达及TH及GAP43两种神经纤维的阳性表达来分析交感神经再生情况。实验四:为了验证lncRNA H19、miR-let-7a和NGF的调控机制,通过RNAhybrid和Targetscan 分别预测了 lncRNA H19 和 miR-let-7a 以及 miR-let-7a 和 NGF 的靶向作用,然后沉默lncRNA H19后行qRT-PCR检测miR-let-7a表达情况,再行双荧光素酶报告基因分析验证以上两者各自直接作用情况。研究结果1.MI 后 7 天,lncRNAH19、NGF 表达上调;2.沉默lncRNA H19降低了 MI后交感神经重构;与假手术组相比,心肌梗死组TH,GAP43阳染面积升高,表明MI后交感神经再生;在心梗造模后左室壁定点注射lncRNA H19沉默慢病毒后,与心肌梗死+对照病毒组相比,心肌梗死+lncRNA H19沉默病毒组TH和GAP43阳染面积显著下降,则沉默lncRNA H19的表达可改善心肌梗死后心脏交感神经的重构;程序性电刺激示:心肌梗死+对照病毒组实验大鼠较假手术+对照病毒组对VAs的易感性增加,而与心肌梗死+对照病毒组相比,心肌梗死+lncRNA H19沉默病毒组VAs成功诱发率下降,评分降低,说明沉默lncRNA H19降低了 MI后的VAs易感性;3.lncRNA H.19通过调控NGF抑制心肌梗死后交感神经重构:如前所述,与假手术组相比,MI 7天后lncRNA H19和NGF表达水平均升高,而随着lncRNAH19的沉默,NGF表达下调;转染NGF过表达病毒可减弱lncRNAH19沉默病毒对NGF蛋白表达的抑制作用,免疫荧光结果显示:转染NGF过表达病毒可部分改善lncRNA H19沉默病毒对TH和GAP43的抑制作用;以上实验结果进一步表明NGF在心梗后交感神经重构中的作用且lncRNA H19通过调控NGF参与了心肌梗死后交感神经重构;4.lncRNA H19 靶向调控miR-let-7a:RNAhybrid预测两者具有靶点结合位点;无论是假手术组还是心肌梗死组,沉默lncRNA H19均使miR-let-7a表达上调;双荧光素酶报告基因结果示:与miR-let-7a质粒共转染显著降低了 lncRNA H19野生型的相对荧光素酶活性,但对突变型几乎没有影响;5.miR-let-7a靶向调控NGF:Targetscan预测两者具有直接作用靶点;双荧光素酶报告基因分析示:与相应的对照相比,miR-let-7a抑制了野生型NGF 3’UTR的荧光素酶活性,而不抑制突变型NGF 3’UTR在293T细胞中的荧光素酶活性,提示NGF是miR-let-7a的直接靶基因。结论1.MI后过表达的lncRNA H19可能在交感神经重构中起着重要作用;2.lncRNA H19 通过 ceRNA 机制结合 miR-let-7a,解除了 miR-let-7a 对其靶基因NGF的抑制作用,NGF表达增加;3.沉默lncRNAH19,抑制了 MI后交感神经的再生重构,干预lncRNAH19-miR-let-7a信号通路将为MI后室性心律失常的防治提供新靶点。