论文部分内容阅读
Zα是能够识别并特异性结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白结构域。鲫鱼PKR-like(PKZ)是首次报道的具有Zα结构域的鱼类蛋白激酶。为深入了解鲫鱼PKR-like(PKZ)Zα的功能，本研究构建替换型Pzα1Zα1的cDNA，并运用PCR定点突变方法构建点突变型(PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A)的cDNA，然后与表达载体连接，转化表达菌BL21(DE3)pLysS并诱导表达。同时，诱导表达野生型PZα1Zα2。镍柱亲和层析纯化获得突变型融合多肽。
另一方面，以pMD18-T质粒为母本质粒，将含有(GC)6、d(GC)13、d(TA)13片段的特殊序列插入到pMD18-T质粒中。甲基化抑制实验证实重组质粒中的插入序列d(GC)6、d(GC)13为“潜在”的Z-DNA。另外，还构建了发夹结构的核酸(d(GC)3T4d(GC)3、d(GC)6Tad(GC)6)和寡聚核苷酸(d(GC)6、d(GC)13)。
凝胶阻滞试验分析3种多肽，即野生型PZα1Zα2、替换型PZα1Zα1和4个点突变型(PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A)，分别与重组质粒的亲和性。结果显示：野生型PZα(Zα1Zα2)和替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)能够对3种重组质粒的迁移产生明显的阻滞效应，并且随着多肽浓度的增大，阻滞效应越明显。与野生型PZα(Zα1Zα2)相比，替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)结合重组质粒的能力更强。4种突变体都不能与3种重组质粒结合，暗示鲫鱼PKR-likeZα结构域这4个氨基酸残基在结合核酸分子的过程中非常关键。
凝胶阻滞实验还分析了野生型PZα1Zα2和替换型PZα1Zα1分别与发夹结构的核酸、寡聚核苷酸的亲和性，结果显示：野生型PZα1Zα2和替换型PZα1Zα1能够与其发生微弱的结合，但其结合能力差异不明显。